CRISPR) ir trešās paaudzes genoma rediģēšanas metode: CRISPR revolucionizēja pasauli

Klasterizēti regulāri izvietoti īsi palindromiski atkārtojumi (CRISPR) ir trešās paaudzes genoma rediģēšanas metode, kas ir revolucionizējusi pasauli ar saviem augstas caurlaidspējas rezultātiem. To izmanto dažādu bioloģisku slimību un infekciju ārstēšanai. Dažādām baktērijām un citiem prokariotiem (piemēram, arhejām) ir arī CRISPR/Cas9 sistēmas, lai aizsargātos pret fāgiem. Ir ziņots, ka uz CRISPR/Cas9 balstītas stratēģijas var kavēt trīskārši negatīva krūts vēža (TNBC) augšanu un progresēšanu, mērķējot uz potenciāli izmainītiem rezistences gēniem, transkripciju un epigenetisko regulāciju. Šīs terapeitiskās intervences var palīdzēt risināt sarežģītas problēmas, piemēram, zāļu rezistenci, kas novērota pat TNBC. Pašlaik tiek izmantotas dažādas metodes, lai piegādātu CRISPR/Cas9 mērķa šūnām, piemēram, fizikālas (mikroinjekcijas, elektroporācijas un hidrodinamiski režīmi), vīrusu (adeno-saistīts vīruss un lentivīruss) un nevīrusu (liposomas un lipīdu nanodaļiņas). Lai gan ir izstrādāti dažādi modeļi, lai pētītu TNBC molekulāros cēloņus, jutīgu un mērķtiecīgu metožu trūkums genoma rediģēšanas rīku piegādei in vivo ierobežo to klīnisko pielietojumu. Rezumējot, šajā pārskatā, pamatojoties uz esošajiem pierādījumiem, vispusīgi tiek pētīts CRISPR/Cas9 ārstēšanas progress, izaicinājumi, ierobežojumi un perspektīvas TNBC ārstēšanā. Mēs arī izceļam, kā mākslīgā intelekta un mašīnmācīšanās kombinācija var uzlabot CRISPR/Cas9 stratēģijas TNBC ārstēšanā.
Vēzim raksturīga nekontrolēta šūnu dalīšanās, šūnu cikla kontrolpunktu traucējumi un mutācijas audzēja nomācošajos gēnos (TSG) (Matthews et al., 2022). Starp dažādajiem vēža veidiem krūts vēzis ir visizplatītākais vēža veids sievietēm un tam ir augsts mirstības līmenis visā pasaulē (Waks and Winer, 2019). Krūts vēzis ir heterogēna slimība ar atšķirīgām īpašībām, piemēram, histoloģiskām un bioloģiskām iezīmēm, klīnisko ainu un uzvedību, kā arī reakciju uz ārstēšanu (Weigelt et al., 2010). Krūts vēža klasifikācija sniedz precīzu ieskatu krūts vēža diagnostikā un audzēja prognozēšanā. Bieži sastopamu biomarķieru un klīniski patoloģisko pazīmju izmantošana ir bijis galvenais krūts vēža klasifikācijas kritērijs (Tsang and Tse, 2019). Krūts vēža prognozi un reakciju uz ārstēšanu ietekmē daudzi faktori, tostarp estrogēnu receptoru (ER), progesterona receptoru (PR), cilvēka epidermas augšanas faktora receptora 2 (HER2/neu) klātbūtne, kā arī histoloģiskā pakāpe, audzēja veids un pakāpe, izmērs un limfmezglu metastāzes (Al-Tubaiti, 2020). Ir identificēti pieci krūts vēža intrinsiskie molekulārie apakštipi, tostarp luminālais A, luminālais B, HER2 bagātinātais, bazāli līdzīgais un klaudīna līmenis zems (Prat et al., 2015). TNBC ir vēža molekulārs apakštips, kas neizpauž visus ER, PR un HER2 (Yin et al., 2020). Šīs patoloģiskās pazīmes ir saistītas ar TNBC, apstiprinot tā straujo progresēšanu un agresīvāko raksturu nekā jebkura cita veida krūts vēzis (Feng et al., 2018). Turklāt Peru et al. (2000) izmantoja mikročipu tehnoloģiju, lai pārklasificētu krūts vēzi un identificētu piecus krūts vēža intrinsiskos apakštipus (Cadenas, 2012). Bazāli līdzīgais krūts vēzis ir krūts vēža apakštips, kam ir trīskārši negatīvs fenotips un kas ir saistīts ar strauju progresēšanu. Jāatzīmē, ka visi bazālie krūts vēži bieži tiek kļūdaini diagnosticēti kā TNBC, bet tikai 77% ir TNBC; Turpretī 71–91 % TNBC ir bazāli līdzīgi, kas norāda, ka šie divi krūts vēža veidi pārklājas un pārstāv dažādas klasifikācijas (Wang D.-Y. et al., 2019). Tas rada nepieciešamību raksturot TNBC heterogenitāti, lai noskaidrotu prognozi un identificētu iespējamās atbildes reakcijas uz pašreizējo un turpmāko ārstēšanu. Turklāt TNBC veido 15–20 % no visiem krūts vēža gadījumiem un ir biežāk sastopama sievietēm līdz 50 gadu vecumam. BRCA1 vai BRCA2 mutācijas ir ziņotas aptuveni 20 % TNBC gadījumu (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Pētījumi ir arī parādījuši, ka TNBC ir atšķirīga imūnā mikrovide, kas ietver augstu asinsvadu endotēlija augšanas faktoru, ar audzēju saistītu makrofāgu (TAM), audzējā infiltrējošu limfocītu (TIL) un citu molekulu līmeni, kas iesaistītas audzēja augšanā un migrācijā. Tāpēc TNBC mikrovides izpratne ir kritiski svarīga tās prognozei un ārstēšanai (Fan un He, 2022).
Lai novērtētu TNBC prognozi un nodrošinātu efektīvu ārstēšanu, ir svarīga precīza diagnoze, kas galvenokārt balstīta uz imūnhistoķīmiju (IHC), lai noteiktu ER, PR un HER2, un mamogrāfiju, lai noteiktu krūts audzējus. Tomēr mamogrāfija nevar pienācīgi attēlot intratumorālas pazīmes, piemēram, nekrozi un fibrozi (Deepak Singh et al., 2021). Tā kā slikta prognoze un diagnoze neļauj ārstiem izrakstīt pareizās zāles (Chaudhary, 2020), pacientu ar TNBC aprūpes uzlabošanai tiek izmantotas dažādas stratēģijas. Pašlaik pacientiem ar TNBC tiek lietotas divas zāles – doksorubicīns un ciklofosfamīds –, un tās ir uzrādījušas labus rezultātus. Turklāt tiek lietotas arī citas platīna zāles, piemēram, karboplatīns un cisplatīns (Sikov et al., 2015). Turklāt PARP inhibitori, piemēram, Olaparibs, Velaparibs un PF-01367338, ir izmantoti kā potenciāli ķīmijterapijas līdzekļi TNBC ārstēšanai (Ishino et al., 2018). Tā kā ir ziņots, ka Wnt/b-katenīna, NOTCH un Hedgehog signālceļi ir iesaistīti TNBC rašanās un progresēšanas procesā, zāļu mērķtiecīga virzīšana uz šiem ceļiem varētu būt svarīga stratēģija (Aysola et al., 2013). Lai gan ķirurģija, staru terapija un ķīmijterapija joprojām ir TNBC ārstēšanas pamatā mūsdienās, ir panākts ievērojams progress jaunu ārstēšanas metožu izstrādē, tostarp mērķterapija, imunoterapija, dažādi ar CRISPR saistīti gēnu rediģēšanas rīki, piemēram, Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, primārā rediģēšana un CRISPR/Cas9 mērķēta gēnu terapija. Šeit mēs pievērsīsimies dažādiem ar CRISPR saistītiem gēnu rediģēšanas rīkiem, ko izmanto TNBC ārstēšanā. Starp tiem CRISPR/Cas9 ir saņēmis plašu uzmanību.
Cas9n, kas pazīstams arī kā Cas9 nikāze, ir ģenētiski modificēta Cas9 proteīna variants, kas iegūts no CRISPR/Cas9 genoma rediģēšanas sistēmas (Gupta et al., 2019). Sākotnējā formā Cas9 proteīns satur divus nukleāzes domēnus: RuvC un HNH, kuru galvenā funkcija ir abu DNS pavedienu šķelšana. Tomēr Cas9n viens no nukleāzes domēniem, HNH, ir ģenētiski mutēts un kļūst neaktīvs. Tādēļ Cas9n HNH domēns paliek nefunkcionāls. Tikai RuvC domēns paliek aktīvs, ļaujot Cas9n pārgriezt vai radīt pārtraukumus atsevišķās DNS pavedienos (Trevino un Zhang, 2014). Salīdzinot ar Cas9, Cas9n var efektīvi samazināt blakusefektus un precīzi uzlabot šūnu atjaunošanas mehānismus. Cas9n var izmantot, lai atrisinātu dažādas problēmas, piemēram, radītu pārtraukumus noteiktās vietās divpavedienu DNS. Šim nolūkam divas Cas9n molekulas tika apvienotas un izmantotas kopā (Yee, 2016). Jauktas līnijas kināze 3 (MLK3) ir mitogēnu aktivēta proteīnkināze, kas kalpo kā galvenais regulators TNBC metastāžu laikā (Cronan et al., 2012).
MLK3 var aktivizēt vairākus signālceļus, kas noved pie TNBC metastāzēm. Piemēram, c-Jun N-termināla kināzes (JNK) ceļš regulē šūnu kustīgumu un ārpusšūnu matrices degradāciju, un MLK3 aktivizē JNK ceļu, tādējādi uzlabojot šūnu kustīgumu un piešķirot invazīvas īpašības (Rattanasinchai un Gallo, 2016). MLK3 regulē arī EMT. Lai to panāktu, tas aktivizē tādus lejupējos transkripcijas faktorus kā Snail, Slug un Twist. Šie faktori kavē epitēlija marķieru ekspresiju un veicina mezenhimālo marķieru ekspresiju, kas noved pie metastātiska fenotipa iegūšanas (Casalino et al., 2023). Ir novērots, ka MLK3 ir loma ECM pārveidošanā un tādu proteāžu kā matricas metaloproteināžu (MMP) aktivizēšanā, kas noārda ECM. Tas veicina audzēja šūnu invāziju un izplatīšanos uz attālām vietām (Katari et al., 2019). Tādējādi iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka MLK3 ir izšķiroša loma TNBC. Rattanasinchai un Gallo izmantoja TNBC modeļus, lai pētītu MLK3 lomu, un atklāja, ka tas veicina vēža attīstību, izmantojot specifiskus signālceļus. Viņi izmantoja CRISPR/Cas9n, lai rediģētu MLK3, un novēroja ievērojamu TNBC metastāžu samazināšanos (Rattanasinchai un Gallo, 2016).
dCas9, ko bieži sauc par neaktīvo Cas9, ir modificēta Cas9 proteīna atvasinājuma forma. Atšķirībā no aktīvā Cas9, dCas9 trūkst endonukleāzes aktivitātes, padarot to nespējīgu izraisīt DNS divpavedienu pārrāvumus. Tādēļ dCas9 var izmantot, lai precīzi iedarbotos uz specifiskiem genoma reģioniem, nemainot vai nemodificējot DNS secību (Wang et al., 2016). dCas9 divi endonukleāzes proteīni, RuvC un HNH, tiek inaktivēti, nomācot svarīgus aminoskābju atlikumus. (Richter et al., 2016). Neskatoties uz DNS šķelšanas aktivitātes trūkumu, dCas9 spēlē vairākas svarīgas lomas ģenētiskajos pētījumos un biotehnoloģijā. Piemēram, tas ļauj vizualizēt specifiskus genoma reģionus, atvieglo transkripcijas regulāciju un veicina epigenetiskas modifikācijas (Brocken et al., 2018).
Transkripcijas faktors ZEB1 (cinka pirksta E-kastes saistīšanās homeoboksa 1) spēlē specifisku un kritisku lomu epitēlija-mezenhimālās pārejas (EMT) mediācijā, kas ir šūnu process, kas notiek embrionālās attīstības, audu atjaunošanās un vēža progresēšanas laikā. Tas ietver epitēlija šūnu transformāciju mezenhimālās šūnās, kā rezultātā mainās šūnu morfoloģija, kustīgums, invazivitāte utt. (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibē vairākus epitēlija marķierus, piemēram, E-kaderīnu un oklūdīnu, kas ir atbildīgi par šūnu-šūnu adhēzijas un epitēlija šūnu polaritātes saglabāšanu TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Turklāt ZEB1 aktivizē noteiktus marķierus, piemēram, N-kaderīnu, vimentīnu un fibronektīnu (Konradi et al., 2014), kā arī regulē gēnus, kas iesaistīti citoskeleta remodelācijā, piemēram, Rho GTPāzes un matricas metaloproteināzes (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), turklāt tas ietekmē arī dažādus signālceļus, piemēram, transformējošo augšanas faktoru β (TGF-β), Wnt signalizāciju utt., tādējādi veicinot audzēja invāziju un metastāzes TNBC (Chen et al., 2016). Neskaitāmi pētījumi un zinātniski pierādījumi liecina, ka ZEB1 ir liels potenciāls kā vērtīgam līdzeklim TNBC atklāšanā un terapeitiskā iejaukšanā. Nesenā pētījumā Waryah et al. izmantoja TNBC modeli un panāca pilnīgu ZEB1 nomākšanu ar dCas9. Tādējādi viņi novēroja ļoti augstu specifiskumu un gandrīz pilnīgu ZEB1 inhibīciju in vivo apstākļos (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 ir gēnu rediģēšanas rīks, ko sauc par CRISPR/Cpf1. Tas ir atvasināts no CRISPR/Cas sistēmas, kur termins Cas12 attiecas uz ar CRISPR saistīto proteīnu 12 (Bharathkumar et al., 2022), kas ir pilnīgi līdzīgs Cas9. Vienīgā atšķirība ir tā, ka tas satur Cas12 proteīnu. Salīdzinot ar Cas9, Cas12 ir dažas unikālas funkcijas, piemēram, lipīgu galu ģenerēšana gēnu rediģēšanas procesā, savukārt Cas9 ģenerē neasus galus (Wang et al., 2021). Šī Cas12 īpašība veicina tā specifisko DNS manipulācijas tehnoloģiju. Kā proteīns, kas spēj precīzi atpazīt un sagriezt mērķa DNS, tam piemīt ārkārtēja daudzpusība, padarot to par efektīvu rīku dažādiem pielietojumiem, tostarp gēnu rediģēšanai (Pickar-Oliver un Gersbach, 2019).
Līdzīgi kā citi CRISPR varianti, arī CRISPR/Cas12 spēj izslēgt vai aktivizēt gēnus TNBC, mērķējot uz gēniem, kuriem ir svarīga loma tā patogenēzē vai reakcijā uz ārstēšanu (Yang un Zhang, 2023). Lai paveiktu šo procesu, tika izstrādāta vadošā RNS (gRNS), kas virza Cas12 uz mērķa gēnu. Kad Cas12 saistās ar savu mērķi, tā ievieš divpavedienu pārtraukumus DNS un aktivizē DNS atjaunošanas mehānismus. Remonta procesa laikā var tikt iekļauti nepareizi nukleotīdi, kas noved pie gēnu mutācijām un funkcijas zuduma (Zhang et al., 2021a). Turklāt gēnu aktivizēšanai tika izmantota arī uzlabota Cas12 enzīma versija (saukta par dCas12). Apvienojot to ar transkripcijas aktivatoru, ir iespējams inducēt noteiktus gēnus, tādējādi tos aktivizējot. Šai tehnoloģijai ir liels potenciāls audzēja nomācošo gēnu aktivācijas veicināšanā (Sultan et al., 2022).
Prime rediģēšana ir jauna un ārkārtīgi pārāka genoma rediģēšanas tehnoloģija. Tā spēj ļoti precīzi modificēt organisma DNS (Chen un Liu, 2023). Prime rediģēšana tiek panākta, integrējot divus galvenos komponentus: modificētu CRISPR/Cas9 enzīmu un reverso transkriptāzi. CRISPR/Cas9 enzīma loma ir selektīvi mērķēt uz precīzām vietām genomā, savukārt reversā transkriptāze palīdz rūpīgi modificēt DNS mērķa vietā (Hassan et al., 2021). Primeru rediģēšanas mehānismā pirmais solis ietver primeru rediģēšanas vadlīniju RNS (pegRNS) izveidi (Standage-Beier et al., 2021). Tā satur mērķa secību un RNS veidni, kas atbilst vēlamajai rediģēšanas vietai mērķa DNS. Pēc tam pegRNS tiek ievadīta mērķa šūnās kopā ar primeru rediģēšanas nukleāzi (PE2). PE2 ir saplūšanas proteīns, kas sastāv no Cas9 enzīma, reversās transkriptāzes un primeru rediģēšanas adaptera (Martín-Alonso et al., 2021). Šūnas iekšienē pegRNS un PE2 kompleksi meklē specifisko DNS, kuru tie vēlas modificēt. Cas9 enzīms sagriež DNS un izveido veidni, kas sastāv no atsevišķām pavedēm (Choi et al., 2022). Reversā transkriptāze izmanto šo veidni, lai sagatavotu DNS rediģēšanai. Līdztekus DNS kopēšanai tiek iekļautas arī instrukcijas RNS veidnes rediģēšanai. Visbeidzot, jaunizveidotā DNS virkne tiek izmantota kā veidne, lai labotu DNS pārtraukumu, kā rezultātā tiek iegūta izmainīta DNS secība, kas satur vēlamo modifikāciju (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Praimeru rediģēšanas mehānismi var izraisīt plaši izplatītas mutācijas gēnos. Tie var būt vērsti uz punktmutācijām, ievietojumiem, dzējumiem un pat gēnu aizvietojumiem (Anzalone et al., 2019; Chen un Liu, 2023). Praimeru rediģēšana piedāvā vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar iepriekšējām genoma rediģēšanas tehnoloģijām. Tās ietver paaugstinātu precizitāti, samazinātu blakusefektu un iespēju rediģēt DNS, nepaļaujoties uz DNS divpavedienu pārtraukumiem (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 tehnoloģija sākotnēji tika izstrādāta, lai aizsargātu baktērijas no plazmīdu pārneses un fāgu infekcijas, un vēlāk tika pārveidota par efektīvu uz RNS balstītu DNS mērķēšanas rīku genoma rediģēšanai (Jiang un Doudna, 2017). Turklāt ir ziņots, ka CRISPR/Cas9 sistēma ir sastopama attiecīgi 50% un 87% baktēriju un arheju genomu (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 ir potenciāls rīks jebkuras patoloģiskas ģenētiskas secības dzēšanai, ievietošanai un korekcijai, izmantojot in vivo un in vitro režīmus (Sabit et al., 2021). Turklāt ir pierādīts, ka CRISPR/Cas9 ir daļa no adaptīvās imūnsistēmas, pateicoties tās specifiskumam attiecībā uz interesējošiem mērķa gēniem (Chen un Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 sastāv no Cas9 un vienas vadošās RNS (sgRNS). Cas9 ir endonukleāze, kas sastāv no vairākiem olbaltumvielu komponentiem. Turklāt Cas9 piemīt unikālas strukturālas un konformācijas īpašības (Pacesa et al., 2022), jo tā sastāv no divām daivām: atpazīšanas (REC) un nukleāzes (NUC). REC daiva ir tālāk sadalīta trīs reģionos: REC1, REC2 un tilta spirāles (Cromwell et al., 2018). NUC sastāv no trim daivām, proti, RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH un protospacer blakus esošā motīva (PAM) mijiedarbības domēna (1. att.) (Song et al., 2016). sgRNS sastāv no diviem komponentiem, tostarp CRISPR RNS (crRNS) un transkodējošās mazās RNS (marķiera RNS) (1. attēls). sgRNS savieno Cas9 proteīnu ar koneksīniem, veidojot aktīvu kompleksu, kas pazīstams arī kā efektora komplekss (Richter et al., 2012). crRNS ir 18–20 nukleotīdu bāzes pāris, kam ir izšķiroša nozīme mērķa DNS sekvenču atpazīšanā. Turklāt crRNS veido pārus ar mērķa DNS, un tracrRNS darbojas kā karkass Cas9 nukleāzei, lai tā saistītos ar mērķa DNS (Manghwar et al., 2019). Savukārt PAM sekvencei ir 3 nukleotīdi, kas apstiprina, precizē un mediē efektora kompleksa saistīšanos ar DNS. Cas9 proteīna kompleksa apakšvienībām RuvC un HNH piemīt katalītiska aktivitāte (Richter et al., 2012; Asmamaw un Zawdie, 2021). Cas9 apakšvienības HNH nukleāzes domēns šķeļ ar crRNS saistīto DNS virkni. RuvC nukleāzes domēns šķeļ citas DNS virknes un ģenerē dubultpavedienu pārrāvumus (DSB), pēc kuriem tiek aktivizēti divi dažādi DNS pārrāvumu labošanas mehānismi (Jiang un Doudna, 2017) (1. attēls).
1. attēls. CRISPR/Cas9 pārskats (A). CRISPR/Cas9 sistēmas komponenti: (i). Cas9 endonukleāze ir atbildīga par mērķa DNS sekvences griešanu, (ii) viena vadošā (sg) RNS, kas rodas no crRNS un tra-crRNS himēru saplūšanas. (divi). Cas9 ietver vairākus komponentus, piemēram, Rec I, Rec II, NUC daivu (HNH un Ruv C ir apakškomponenti) un PAM mijiedarbības domēnu (C) ar atbilstošām funkcijām. CRISPR/Cas9 proteīnu komplekss šķeļ DNS sekvences nekomplementārās un komplementārās formās (D). CRISPR/Cas9 rediģē genomu trīs posmos: atpazīšana, griešana un labošana. Izstrādātā sg-RNS vada Cas9 un atpazīst vēlamo secību caur komplementāro komponentu crRNS. Cas9 atpazīst PAM secību 5′-NGG-3′ un izkausē DNS, veidojot DNS-RNS hibrīdu un aktivizējot šķelšanu. Cas9 HNH domēns šķeļ komplementāro virkni, un RuvC domēns šķeļ nekomplementāro virkni. CRISPR/Cas9 atjauno divpavedienu DNS, to sadalot divos veidos: nehomologā galu savienošanā (NHEJ) un homoloģijas vadītā atjaunošanā (HDR). NHEJ atjauno divpavedienu DNS bez svešas homologas DNS, izmantojot fermentatīvu procesu – kļūdu pakļautu mehānismu, kas var ievietot vai noņemt nejaušas DNS sekvences. HDR ir ļoti specifisks un tam ir nepieciešamas homologas DNS veidnes.
CRISPR/Cas9 mediētie labošanas ceļi ietver nehomologus galu savienošanas (NHEJ) un homoloģijas virzītus labošanas (HDR) mehānismus. NHEJ ir kļūdu pakļauts ceļš, jo tas ietver ievietošanu vai dzēšanu un labošanas mehānisma laikā neprasa nekādu modeli. Tas izmanto nejaušus nukleotīdus, lai ģenerētu standarta proteīnus (Abbasi et al., 2021). Šī labošanas sistēma sastāv no četriem kompleksiem, piemēram, KU kompleksa, 4. tipa krusteniski komplementējošā proteīnu kompleksa (XRCC-4), DNS galu apstrādes enzīma un proteīnkināzes DNS-PKcs (Abbasi et al., 2021). KU kompleksa proteīnam ir divas apakšvienības, Ku 70 un Ku 80, un tam ir svarīga loma NHEJ mehānismā, jo labošanas mehānismu ierosina divu apakšvienību (Ku 70 un Ku 80) saistīšanās ar mērķa DNS neasajiem vai gandrīz neasajiem galiem (Abbasi et al., 2021), kalpojot kā karkass citu ar NHEJ saistītu faktoru piesaistīšanai traumas vietai (Yang et al., 2020). XRCC-4 un DNS ligāze sastāv attiecīgi no 334 un 911 aminoskābēm, un XRCC4-DNS ligāzes IV komplekss stimulē DNS galu ligēšanu (Chatterjee et al., 2015). DNS galu apstrādes enzīms, kas pazīstams arī kā polinukleotīdu kināzes 3′-fosfāts, ir DNS galu apstrādes enzīms. Tas var noņemt 3′P grupu DNS un fosforilēt 5′OH grupu DSB labošanas laikā. Tas ietver arī vienpavedienu pārrāvumu (SSB) atjaunošanu, izmantojot SSB atjaunošanas ceļu (Chatterjee et al., 2015). Proteīnkināze DNS-PKcs ir no DNS atkarīga proteīnkināze, kas sastāv no PIKK (fosfatidilinozitola 3-kināzes saistīto kināžu) un ataksijas telangiektāzijas mutāciju skarto (ATM) kināžu saimes katalītiskās apakšvienības, kā arī ar ATM un Rad3 saistītiem ATR, virknes pārrāvumiem (DSB) un vienpavedienu pārrāvumiem (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR ir precīzāks un piemērotāks labošanas mehānisms, jo informācija tiek kopēta, izmantojot homologā DNS dupleksa neskarto formu, lai gan tam nepieciešama māshromatīdu klātbūtne. Tas notiek zīdītāju šūnu cikla S/G2 fāzē. HDR galvenokārt rodas rauga sugās, bet NHEJ ir kritiski svarīgs zīdītājiem (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Pilns labošanas mehānisms ir parādīts 1. attēlā.
Tā kā TNBC izraisa ģenētiskas un epigenetiskas anomālijas, ļaundabīgu genoma/epigenoma anomāliju korekcija, izmantojot CRISPR/Cas9, var būt saprātīga terapeitiska pieeja (Chen et al., 2019). Turklāt daži transkripcijas faktori, kas iesaistīti šūnu specifiskā transkripcijas regulācijā, var uzrādīt unikālas vēža šūnu īpašības, kas liecina, ka transkripcijas regulācija varētu būt lieliska pieeja vēža ārstēšanai (Drost et al., 2017). Šo audzēju molekulāro īpašību, piemēram, ģenētisko, epigenetisko un transkripcijas defektu, izmantošana zāļu izstrādē var uzlabot klīniskos rezultātus un samazināt skrīninga izmaksas. CRISPR ir potenciāls gēnu rediģēšanas rīks, kas var ne tikai atklāt un identificēt vēzi izraisošus genoma mērķus, bet arī tikt izmantots, lai rediģētu, nomāktu un epigenetiski modificētu onkogēnus cilvēka šūnās (1. tabula) (Ahmed et al., 2021). Ir veikti vairāki CRISPR skrīningi, lai meklētu gēnus, kas saistīti ar audzēja nomācējiem, onkogēniem un zāļu rezistenci. CRISPR/Cas9 izmantošana dažādu TNBC onkogēnu rediģēšanai ir parādīta 2. attēlā.
2. attēls. Dažādu TNBC onkogēnu gēnu rediģēšana, izmantojot CRISPR/Cas9, kā rezultātā samazinās audzēja augšana un metastāzes. Šie onkogēni ietver CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 un CXCR7, Crypto1, ROR1 un ST8SIA, kas ir iesaistīti TNBC rašanās un metastāžu veidošanā.
Vēža šūnu migrācija, invāzija un epitēlija-mezenhimālā pāreja (EMT) ir saistītas ar ITGA9. Iepriekšējie pētījumi liecina, ka ITGA9 ir galvenais Notch ceļa spēlētājs un tam ir interesanta loma rabdomiosarkomas metastāzēs (Molist et al., 2020). Turklāt tika atklāts, ka ITGA9 ir cieši saistīts ar pacientu prognozi vairākos audzēju veidos, tostarp krūts vēža gadījumā (Wang Z. et al., 2019). Turklāt ITGA9 bioinformātiskā analīze parādīja, ka tā ekspresija TNBC bija ievērojami augstāka nekā citos krūts vēža apakštipos. Paaugstināts ITGA9 līmenis ir saistīts ar audzēja metastāzēm un recidīvu TNBC pacientiem. ITGA9 izslēgšana ar CRISPR/Cas9 izraisīja vēža cilmes šūnām (CSC) līdzīgas īpašības, audzēja angioģenēzi, audzēja augšanu un samazinātu metastāžu veidošanos, veicinot β-katenīna degradāciju TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Kripto-1 pieder pie TGF-β saimes un ir kritiski svarīgs agrīnai embrioģenēzei, cilmes šūnu uzturēšanai un vēža metastāzēm (Ishii et al., 2021). Pazīstams arī kā Tdgf-1, tas ir onkogēns GPI piesaistīts signālceļš, kas iesaistīts primitīvās svītras, mezodermas un endodermas veidošanās regulēšanā, kā arī kreisās/labās asimetrijas veidošanā ķermeņa orgānu attīstībā embrioģenēzes laikā (Zhang et al., 2021b). Turklāt ir pierādīts, ka Cripto-1 ir iesaistīts epitēlija-mezenhimālajā pārejā (EMT) kā cilmes šūnu marķieris (Zhang et al., 2021b). EMT ir kritiski svarīgs ne tikai dažādiem procesiem, piemēram, embrionālajai attīstībai, fibrozei un brūču dzīšanai, bet arī vēža invāzijai un metastāzēm. Turklāt ir pierādīts, ka Cripto-1 mijiedarbojas ar četriem Notch receptoriem un veicina to pēctranslācijas nobriešanu (Brandstadter un Maillard, 2019). Ir zināms, ka Notch signālceļš ir iesaistīts cilvēka krūts vēža šūnu uzturēšanā. Pētījumi liecina, ka CRISPR/Cas9 mediētā Crypto-1 izslēgšana nomāc vēža augšanu un metastāzes. Tādēļ Crypto-1 varētu kļūt par svarīgu terapeitisko mērķi TNBC (Castro et al., 2015).
XCL12 proteīnam un tā hemokīnu receptoram CXC (CXCR4 un CXCR7) ir dažādas lomas vēža šūnu proliferācijā, augšanā, migrācijā un invāzijā (Wu et al., 2015). Šie hemoreceptori ir saistīti ar TNBC attīstību, izmantojot vairākus signālceļus gan in vivo, gan in vitro modeļos (Wu et al., 2015). Turklāt CXCR4 un CXCR7 aktivācija ir saistīta ar lielāku uzņēmību pret metastāzēm un sliktu prognozi TNBC gadījumā (Karn et al., 2022). Tādēļ CXCR4 un CXCR7 izslēgšana var kļūt par efektīviem zāļu mērķa gēniem krūts vēža, tostarp TNBC, ārstēšanā. Janga et al. pētījumā Janga et al. (2019) izmantoja CRISPR/Cas9, lai līdzizslēgtu CXCR4 un CXCR7 gēnus, un atklāja, ka TNBC proliferācija, augšana, migrācija un invāzija tika ievērojami kavēta (Yang et al., 2019).
Krūts vēža audos tika novērots paaugstināts miR-3662, TNBC onkogēna, līmenis (Yi et al., 2022). Ir pierādīts, ka miR-3662 ekspresijas nomākšana kavē krūts vēža audzēja augšanu un metastāzes gan in vivo, gan in vitro (Agarwal un Gupta, 2021). HBP-1 ir spēcīgs Wnt/-katenīna signālceļa inhibitors un, visticamāk, ir atbildīgs par miR-3662 mediētu TNBC šūnu augšanu. Nesen Yi et al. atklāja, ka miR-3662-HBP1 ass regulē Wnt/-katenīna signālceļu TNBC šūnās (Yi et al., 2022). Pateicoties audzējam specifiskajai ekspresijai, miR-3662 varētu būt potenciāls terapeitiskais mērķis TNBC. Tādējādi CRISPR/Cas9 mediēta miR-3662 ekspresijas nomākšana varētu būt lieliska pieeja jaunu zāļu izstrādei TNBC ārstēšanai.
UBR5 ir 300 kDa nukleofosfoproteīns, kas ir identificēts kā galvenais audzēja veidošanās, metastāžu un imūnās atbildes regulators dažādos vēža veidos (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Ir ziņots, ka UBR5 ir ļoti paaugstināts TNBC paraugos un stimulē ERα funkciju, inducējot proliferāciju, izmantojot savu ubikvitīna ligāzes aktivitāti (Bolt et al., 2015). Pilna eksoma sekvencēšanas pētījumi primārajos TNBC paraugos arī uzrādīja paaugstinātu UBR5 ekspresiju, kas liecina par tā lomu TNBC attīstībā. Turklāt CRISPR/Cas9 izraisīta UBR5 delēcija uzrādīja ievērojamu TNBC metastāžu un augšanas inhibīciju eksperimentālos peļu modeļos. Turklāt UBR5 iekļaušana savvaļas tipa peļu modelī atjaunoja tā pilnu funkcionalitāti, savukārt šis efekts netika novērots inaktivētos mutantu celmos (Liao et al., 2017). UBR5 trūkums ir saistīts ar paaugstinātu apoptozi, nekrozi un audzēja augšanas inhibīciju TNBC sliktas angioģenēzes dēļ. UBR5 zuduma dēļ audzēja izplatība uz attāliem orgāniem samazinās, un UBR5 izraisa patoloģisku EMT, galvenokārt samazinot E-kaderīna ekspresiju (Zhang un Weinberg, 2018). Nesen tika pierādīts, ka UBR5 ir ļoti svarīgs faktors IFN-γ inducētā PDL1 transkripcijā TNBC, jo tam trūkst E3 ubikvitinācijas aktivitātes. RNS transkriptoma analīze atklāja, ka UBR5 var būt sistēmiska ietekme uz gēniem, kas saistīti ar IFN-γ ceļu, un veicināt PDL1 transaktivāciju, palielinot proteīnkināzes RNS (PKR) un tās signāla pārveidotāju un aktivatoru aktivācijas līmeni. transkripcija 1 (STAT1) un interferona regulējošais faktors 1 (IRF1). Tomēr CRISPR/Cas9 mediētā kombinētā UBR5 un PD-L1 ekspresijas ablācija rada sinerģisku terapeitisku efektu nekā katra blokāde atsevišķi, ar dziļu ietekmi uz audzēja mikrovidi (Wu et al., 2022). Tādējādi CRISPR/Cas9 var būt svarīgs instruments UBR5 funkcijas inhibēšanai, tādējādi nomācot TNBC metastāzes un audzēja augšanu.
ROR1 ir I tipa transmembrānas proteīns, kas tiek ekspresēts vēža un embrionālās attīstības laikā, un ir identificēts kā onkofetāls proteīns (Nicholas Borcherding, 2014). Dažādu cilvēka vēža veidu invazīvā uzvedība ir saistīta ar ROR1 regulācijas palielināšanos. Daudzsološi rezultāti ir iegūti in vivo un in vitro pētījumos, kuros iesaistīti terapeitiski savienojumi, kas vērsti pret ROR1 (Chien et al., 2016). Paaugstināts ROR1 mRNS līmenis krūts audu biopsijās ir saistīts arī ar agresīviem bazāli līdzīgiem krūts (BL) audzējiem un to migrāciju uz citām ķermeņa daļām. Turklāt ROR1 pārekspresija ir identificēta kā prognostisks marķieris TNBC attīstībai (Chien et al., 2016). Tomēr ROR1 apklusināšana, izmantojot CRISPR/Cas9, lai nomāktu TNBC augšanu un metastāzes, būtu efektīva stratēģija.
Sializācijas process ietver siālskābes pievienošanu glikokonjugātiem, ko katalizē sialiltransferāzes (ST). ST8SIA1 pieder pie ST saimes un tam ir svarīga loma dažādu slimību, piemēram, limfoleikozes un kolorektālā vēža, patogenezē (Chang et al., 2018). RNS sekvences analīze liecina, ka ST8SIA1 ir ļoti ekspresēts TNBC pacientu krūts audos un ir pozitīvi korelēts ar mutācijām audzēja nomācošajā gēnā p53, kas var veicināt TNBC patogenezi (Battula et al., 2017). Turklāt ST8SIA1 ir iesaistīts TNBC metastāzēs un recidīvā, kas liecina, ka tam ir svarīga loma TNBC rašanās un attīstības procesā. TNBC in vitro modelī tika pierādīts, ka ST8SIA1 ekspresijas nomākšana ar CRIPSR/Cas9 bloķē augšanu un metastāzes (Battula et al., 2017). Tas liecina, ka CRISPR/Cas9 varētu būt svarīgs instruments ST8SIA1 onkogēna funkcijas inhibēšanai TNBC ārstēšanā.
NAT1 ir vielmaiņas enzīms, kas katalizē II fāzes ksenobiotisko savienojumu veidošanos un tiek ekspresēts gandrīz visos cilvēka audos. NAT1 var izmantot kofaktoru folātu, lai iedarbotos uz acetil-CoA (acetil-CoA) pat bez aromātiskā amīna substrāta (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Pētījumi liecina, ka NAT1 regulē matricas metaloproteināzes 9 (MMP9) funkciju krūts vēža šūnu modeļos un aizsargā pret reaktīvajām skābekļa sugām (ROS) glikozes bada laikā (Wang et al., 2018). Ir pierādīts, ka NAT1 dzēšana inhibē piruvātdehidrogenāzes kompleksu, izraisot mitohondriju disfunkciju (Wang L. et al., 2019). Turklāt dažādi citi ziņojumi ir parādījuši, ka NAT1 inhibīcija, izmantojot mazas molekulas un siRNA apklusināšanu, var samazināt krūts vēža šūnu invazivitāti un proliferāciju (Stepp et al., 2018). Nesen CRISPR/Cas9 tika izmantots, lai nomāktu NAT1 krūts vēža šūnu līnijā MDA-MB-231, ietekmējot šūnu metabolismu atkarībā no tā ekspresijas līmeņa. Šis pētījums arī parādīja, ka NAT-1 ir kritiski svarīgs TNBC progresēšanai un metastāzēm (Carlisle et al., 2020).
Onkogēnu koordinētu transkripciju regulē superpastiprinātāji, transkripcijas faktori un kofaktori (Hnisz et al., 2015). Turklāt transkripcijas regulēšanai ir nepieciešama ciklīnatkarīgu kināžu (CDK) grupa, piemēram, CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 un CDK13. Starp tām CDK7 ir iesaistīts RNS polimerāzes II fosforilēšanā, kas ir ļoti svarīga onkogēnu transkripcijas uzsākšanai un paplašināšanai TNBC patogenezē. Fundamentālā pētījumā CDK7 dzēšana ar CRISPR/Cas9 inhibēja TNBC, norādot, ka TNBC patogeneze ir atkarīga no CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Pētījumi liecina, ka MYC un RBP (RNS saistošais proteīns) mutācijas var izraisīt apoptozi, savukārt atsevišķas MYC vai RBP gēna mutācijas neietekmē vēža šūnu augšanu (Einstein et al., 2021). Izmantojot CRISPR/Cas9 balstītu bibliotēku, ir pārbaudīti vairāk nekā 1000 RBP cilvēka genomā. Starp tiem 57 RBP tika atzīti par kritiski svarīgiem vēža šūnu augšanai ar ļoti paaugstinātu MYC līmeni (Wheeler et al., 2020). Turklāt YTHDF2 ir svarīgs TNBC šūnu augšanas uzturēšanai un samazina metilēto transkriptu daudzumu augsta līmeņa transkripcijas un translācijas laikā vēža šūnās ar augstāku MYC ekspresiju. Turklāt YTHDF2 nav būtisks vēža šūnām, kuras ir mazāk atkarīgas no paaugstināta MYC līmeņa, lai pagarinātu TNBC pacientu izdzīvošanu (Einstein et al., 2021), kas liecina, ka tas varētu būt potenciāls terapeitiskais mērķis zālēm, kas var pārvarēt TNBC.
Cinka pirkstu proteīni (ZNF) veido aptuveni 1% no kopējā cilvēka genoma. Pētījumi liecina, ka ZNF var regulēt šūnu proliferāciju dažādos vēža veidos, piemēram, aknu vēzī, krūts vēzī un kolorektālajā vēzī (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Ar CRISPR izslēgšanu ģenerētās bibliotēkas ir izmantotas, lai skrīningu veiktu dažādos audzēja nomācošo gēnu (TSG) krūts vēža šūnās (Shalem et al., 2014). Kopš tā laika transkriptomikas pētījums ar CRISPR/Cas9 ZNF319-dzēstām krūts vēža šūnām ir parādījis, ka ZNF319 ir audzēja nomācošais gēns, kas samazina krūts vēža proliferāciju, un tāpēc ir iesaistīts dažādos potenciālos signalizācijas mehānismos un citās bioloģiskās funkcijās (Wang L. et al., 2022).
Ferroptoze ir programmētas šūnu nāves veids, kas ir atkarīgs no dzelzs klātbūtnes. Ir zināms, ka ferroptozes attīstību ietekmē lipīdu peroksīdu klātbūtne. Turklāt ir ziņots, ka PKCβII uzrāda agrīnu lipīdu peroksidāciju, un pastiprināta lipīdu peroksidācija ir saistīta ar ferroptozi. CRISPR/Cas9 mediēto kināzes inhibitoru bibliotēkas skrīnings atklāja, ka PKCβII ir iesaistīts lipīdu peroksidācijas procesā, kas ir kritiski svarīgs ferroptozes procesam MDA-MB-231 šūnās (Zhang et al., 2022). Tādēļ tas liek domāt, ka PKCβII izslēgšana ar CRISPR/Cas9 varētu būt potenciāls audzēja nomācošā gēna mērķis ar ferroptozi saistītu slimību ārstēšanai (Zhang et al., 2022).
Tiek uzskatīts, ka zāļu rezistence ir atbildīga par aptuveni 90% nāves gadījumu vēža pacientiem un ir viena no galvenajām problēmām vēža ārstēšanā (Bukowski et al., 2020). Rezultāti liecina, ka pietiekams skaits gēnu, kas saistīti ar zāļu izplūdi, DNS atjaunošanu, apoptozi un dažādiem šūnu signalizācijas ceļiem, ir saistīti ar zāļu rezistenci (Haider et al., 2020). Starp tiem vairāki gēni ir tikuši mērķēti ar CRISPR/Cas9 rīkiem, un tie ir uzrādījuši daudzsološus rezultātus zāļu rezistences mazināšanā un pretvēža ārstēšanas efektivitātes palielināšanā (Vaghari-Tabari et al., 2022). Turklāt augstas caurlaidības CRISPR/Cas9 gēnu izslēgšanas skrīninga bibliotēkas ir iesaistītas potenciālo zāļu rezistences gēnu mērķu funkcijas modificēšanā (Shalem et al., 2015). Lai identificētu paklitaksela rezistences gēnus, tika izmantota RNS sekvencēšana apvienojumā ar genoma mēroga sgRNS bibliotēkas skrīningu, lai identificētu astoņus kandidātgēnus, tostarp histona deacetilāzi 9 (HDAC9), kas ir saistīti ar zāļu rezistenci pacientiem ar recidivējošu TNBC (B et al., 2020). Citā pētījumā TNBC pacientu, kuri tika ārstēti ar pretvēža zālēm, izdzīvošanas laikā tika novērota palielināta diserīna/treonīna un tirozīna proteīnkināzes (DSTYK) ekspresija. Turklāt CRISPR/Cas9 mediētā DSTYK ekspresijas nomākšana ievērojami pastiprināja pret zālēm rezistentu vēža šūnu apoptozi in vitro (SUM102PT šūnas un MDA-MB-468 šūnas) un in vivo TNBC modelī (Ogbu et al., 2021).
Lai gan TNBC ir patoloģiska MAPK ceļa aktivācija, MEK mērķterapiju klīniskā iedarbība ir vāja. CRISPR/Cas9 genoma bibliotēkas skrīnings atklāja, ka PSMG2 (proteomu montāžas šaperons 2) inhibīcija sensibilizē TNBC BT549 un MB468 šūnas pret MEK inhibitoru AZD6244. CRISPR/Cas9 PSMG2 nomākšana izmainīja normālu proteasomu funkciju, izraisot autofāgijas mediētu PDPK1 demontāžu, tādējādi vēl vairāk uzlabojot audzēja šūnas TNBC peļu modeļos, ko inducē AZD6244 (MEK inhibitors) un MG132 (proteasomu inhibitors). Tādējādi proteasomu un MAP kināzes (MEK) inhibitorus var ievadīt sinerģiski, lai samazinātu audzēja šūnu proliferāciju (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 ir izmantots arī, lai pārbaudītu gēnu funkcijas zudumu, kas izraisa TNBC rezistenci (Shu et al., 2020). Ge et al. paskaidroja zāļu rezistences mehānismu vēža šūnās, kas apstrādātas ar JQ1, BET bromodomēna inhibitoru (BBDI), TNBC. Izmantojot CRISPR/Cas9, viņi atklāja, ka rb1 gēna dzēšana izraisīja TNBC rezistenci pret pretvēža zālēm JQ1. Tāpēc rb1 funkcijai ir svarīga loma reakcijā uz JQ1 zālēm TNBC. Viņi arī ziņoja, ka paklitaksels ir CDK4/6 kināzes/mikrotubulu inhibitors, un tā kombinācija ar BBDI, piemēram, JQ1, var nodrošināt daudzsološas terapeitiskas atbildes reakcijas pret zālēm rezistentām TNBC (Ge et al., 2020).
Ir ziņots, ka garās nekodējošās RNS (lncRNS) transkripcijas ainava ir atbildīga par rezistenci pret neoadjuvantu terapiju TNBC gadījumā. Šis pētījums parāda, ka TNBC ir izteikti ekspresēti pieci dažādi MALAT1 lncRNS transkripti. Turklāt CRISPR/Cas9 mediētā MALAT1 delēcija palielināja TNBC BT-549 šūnu jutību pret paklitakselu un doksorubicīnu, kas liecina par iespējamu MALAT1 rezistences lomu TNBC gadījumā (Shaath et al., 2021).
BRCA1 (BRCA1m) mutācijas ir heterogēnas un tāpēc ir grūti atklāt. PARP1 (poli(ADP-ribozes) polimerāze), BRCA1 sintētiskais letālais partneris, mērķtiecīga iedarbība var palielināt TNBC zāļu ķīmisko jutību. Izmantojot CRISPR/Cas9, PARP1 dzēšana palielināja pretvēža zāļu, piemēram, doksorubicīna, gemcitabīna un docetaksela, jutību pret mBRCA1 mutantu TNBC šūnām, kas liecina, ka PARP1 ir iesaistīts arī zāļu rezistencē TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Ir zināms, ka mutācijas audzēja nomācošajos gēnos BRCA1 vai BRCA2 palielina krūts vēža attīstības iespējamību cilvēkiem. Šo pacientu ārstēšanai nepieciešama PARP inhibitoru lietošana. Turklāt ir pierādīts, ka nukleotīdu glābšanas faktora DNPH1 izslēgšana, izmantojot CRISPR/Cas9, var noņemt toksisko nukleotīdu 5-hidroksimetildeoksiuridīna (hmdU) monofosfātu, tādējādi uzlabojot BRCA deficītu šūnu reakciju uz jutību pret PARP inhibitoriem (Fugger et al., 2021). Tādējādi CRISPR/Cas9 un PARP1 inhibitori var kļūt par svarīgu TNBC ārstēšanas stratēģiju.
Penetrantā glikoproteīna (P-gp) gēns ir vairāku zāļu rezistences gēns, kas parasti ir paaugstināts aptuveni 41% no visiem TNBC gadījumiem (Sun et al., 2020). P-gp izraisīta zāļu izplūde ir identificēta kā galvenais zāļu rezistences regulators krūts vēža gadījumā. P-gp inhibitori ir pierādījuši paaugstinātu jutību pret pretvēža zālēm krūts vēža gadījumā (Famta et al., 2021). Tādējādi CRISPR/Cas9 mediēta P-gp un P-gp inhibitoru ablācija vai nomākšana var būt ļoti svarīgas metodes, lai pārvarētu zāļu rezistenci TNBC.
Ir zināms, ka ATP saistošais kasešu transportētājs G2 (ABCG2) izraisa zāļu rezistenci TNBC (Palasuberniam et al., 2015), lai gan pašlaik nav ziņojumu par saistību starp CRISPR/Cas9 un ABCG2 apklusināšanu un audzēja nomācošo gēnu inaktivāciju. PTEN var pastiprināt ABCG2 aktivāciju (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Tādēļ CRISP/Ca9 izmantošana ABCG2 noņemšanai un tā kombinēšana ar ABCG2 inhibitoru varētu būt piemērota ārstēšanas metode zāļu rezistences pārvarēšanai TNBC. 2. tabulā minēta CRISPR/Cas9, kas vērsts pret visiem rezistences gēniem.
2. tabula. CRISPR/Cas9 iedarbojas uz dažādiem TNBC rezistences gēniem, lai sensibilizētu šūnas pret pretvēža zālēm.
CRISPR/Cas9 bibliotēkas ir potenciāli rīki ar vēža patogenēzi saistītu gēnu mutāciju skrīningam (Chan et al., 2022). Šī skrīninga metode ietver četrus soļus, piemēram, (a) bibliotēkas izveidi, (b) lentivīrusu transdukciju, (c) fenotipisko skrīningu un (d) mērķa gēnu analīzi. Lai gan TNBC ir patoloģiska MAPK ceļa aktivācija, MEK mērķterapijas klīniskā prognoze TNBC pacientiem ar mutācijām audzēja nomācošos gēnos, piemēram, PTEN, RB1 un TP53, ir ļoti slikta.
Turklāt gēnu izslēgšanas skrīnings, izmantojot CRISPR/Cas9, pārbaudīja visspēcīgāko un selektīvāko molekulu - dehidrokatrolu, kas ir bagātīgi atrodams Gvatemalas ziedu un lapu ekstraktos, lai izprastu dehidrokatrola ietekmi uz MDA-MB-231. Selektīvās šūnu citotoksicitātes mehānismi. TNBC apakštipu mezenhīmas stumbra raksturojums. Šis uz CRISPR/Cas9 balstītais skrīnings arī atklāja, ka HSD17B11, gēns, kas kodē 17β-hidroksisteroīdu dehidrogenāzes 11. tipu, ir ļoti ekspresēts MDA-MB-231 šūnās un rada dehidrofalkarinolu, kas ir specifisks MDA-MB-231 šūnām (Grant et. al., 2020). Tādējādi tas liecina, ka CRISPR/Cas9 genoma skrīningam ir liels potenciāls, lai identificētu mehānismus, kas ir potenciālo dabisko savienojumu pretvēža īpašību pamatā.
Turklāt TNBC ievainojamība pret vēzi tika pētīta, izmantojot objektīvu genoma mēroga in vivo CRISPR/Cas9 skrīningu, kas parādīja saikni starp onkogēniem un audzēja nomācošiem ceļiem. Ir ziņots, ka mTOR un Hippo ceļu galvenajām sastāvdaļām ir svarīga loma audzēja regulācijā TNBC. Turklāt pētījumi ir parādījuši, ka mTORC1/2 un YAP onkoproteīna farmakoloģiskā inhibīcija efektīvi inhibē TNBC patogenitāti, izmantojot in vitro zāļu matricas sinerģijas modeli un in vivo no pacientiem iegūtus ksenotransplantātus. Turklāt Torin-1 mediētā mTORC1/2 inhibīcija pastiprina makropinocitozi, savukārt verteporfīna izraisīta YAP inhibīcija noved pie TNBC šūnu nāves. Kopumā šie rezultāti izceļ genoma mēroga in vivo CRISPR skrīninga spēku un noturību, lai identificētu jaunas un efektīvas TNBC ārstēšanas metodes (Dai et al., 2021).
Imūnsistēmas disregulācija ir svarīgs faktors audzēja ģenēzē. Vēža šūnas izvairās no imūnsistēmas attīrīšanas, apejot aizsardzības mehānismus, tostarp traucējot imūnšūnu aktivitāti audzēja mikrovidē un apdraudot imūnsistēmu. Tādēļ uzlabotas imūnsistēmas izstrāde varētu būt galvenā pieeja cīņā pret audzējiem. CRISPR/Cas9 balstītas gēnu modifikācijas izmantošana no dažādiem skatupunktiem risina vairākus ar imūnsistēmas disfunkciju saistītus jautājumus. CRISPR/Cas9 ir izmantots, lai uzlabotu pretvēža imunitāti pret krūts vēzi, izmantojot šādus ceļus (3. attēls).
3. attēls. CRISPR/Cas9 imunoterapija ir vērsta uz TNBC šūnām. CDK5 zudums un PDL1 un CD155 nomākšana pastiprina imūnsistēmu. Tāpat A2AR zudums un tādu TAA kā HER2, mucīna 1 un TEM8 nomākšana palielināja CAR-T šūnu efektivitāti vēža šūnu iznīcināšanā. CRISPR/Cas9 vadīta T šūnu skrīnings ir parādījis, ka p38 kināzes darbības traucēšana pastiprina T šūnu pretvēža aktivitāti. Ar CRISPR/Cas9 modificētas T šūnas palielina TCR (T šūnu receptora) ekspresiju, kā rezultātā T šūnām piemīt pretvēža aktivitāte.
Imunoterapijas mērķis ir stimulēt imūnsistēmu uzbrukt vēža šūnām. Imūnās kontrolpunktu olbaltumvielu pārekspresija parasti novērš autoimūnas reakcijas, bet var palīdzēt vēža slimniekiem no tām izvairīties (Topalian et al., 2015). Šie proteīni novērš imūnās reakcijas, saistoties ar receptoriem uz imūnšūnu virsmas. Vairāki kontrolpunktu proteīni (piemēram, CD155 un PD-L1) ir vērsti uz PD-1 receptoru uz imūnšūnām un tiek ekspresēti krūts vēzī, īpaši TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). PD-L1 vai tā receptora nomākšana, izmantojot CRISPR/Cas9, var stimulēt imūnsistēmu uzbrukt TNBC audzējiem (Yahata et al., 2019). Turklāt ir pierādīts, ka PD-L1 ekspresijas samazināšana, izmantojot CRISPR/Cas9 mediētu CDK5 dzēšanu, kavē audzēja augšanu in vitro un in vivo (Deng et al., 2020). Augšanas inhibīcija krūts vēža in vitro un in vivo modeļos liecina, ka shRNS mediēta CD155 samazināšana var būt terapeitiska iedarbība uz krūts vēzi (Gao et al., 2018).
CAR T šūnas ekspresē CAR, kas atpazīst ar audzēju saistītus antigēnus (TAA), un var izmantot kontrolpunktu proteīnu nomākšanu, lai pastiprinātu to aktivitāti (Li C. et al., 2020). CAR T šūnu terapijai krūts vēža gadījumā ir dažādi potenciāli mērķi, tostarp vairāki TAA, piemēram, HER2, mucīns 1 un TEM8 (Bajgain et al., 2018). Ir pierādījumi, ka CAR T šūnas, kas vērstas pret mezotelīnu (pārmērīgi ekspresētas TNBC BT-459 šūnās), ir efektīvākas pret vēzi, ja PD-1 tiek izslēgts, izmantojot CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Tomēr T šūnu izolēšana no pacientiem un pēc tam to rediģēšana ex vivo ir darbietilpīgs un laikietilpīgs process. Lai gan universālās T šūnas var samazināt izolācijas prasības, donoru T šūnas, kas ekspresē cilvēka leikocītu antigēna (HLA) I klases un T šūnu receptoru (TCR), ir jāizņem, lai novērstu transplantāta pret saimnieku reakcijas anomālijas (Ren et al., 2017). , 2017a). Izmantojot CRISPR/Cas9, HDR var vienlaikus eliminēt TCR un HLA un izslēgt gēnu, kas kodē CAR. Pētījumi liecina, ka CRISPR/Cas9 var izmantot, lai ievadītu anti-CD19 CAR TCR lokusā, tādējādi efektīvi ražojot CAR, nenoplicinot T šūnas (Dimitri et al., 2022). Ir izstrādātas multipleksu tehnoloģijas, lai ģenerētu allogēnas CAR T šūnas, vienlaikus eliminējot TCR, beta-2-mikroglobulīnu (B2M), HLA-I apakšvienību un citus proteīnus, piemēram, PD-1 un CTLA-4, kuriem var būt lielākas pretvēža īpašības pret TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Izmantojot CRISPR/Cas9, varētu uzlabot CAR-T šūnu efektivitāti. Ir zināms, ka adenozīnam piemīt imūnsupresīvas īpašības un tas var samazināt pretvēža imunitāti, bloķējot T šūnu darbību un aktivizējot adenozīna A2A receptorus (A2AR) (Vigano et al., 2019). A2AR apklusināšana, izmantojot CRISPR/Cas9, ievērojami uzlaboja CAR-T šūnu efektivitāti in vivo (Giuffrida et al., 2021). Ir zināms, ka T šūnām piemīt dažādas fenotipiskas īpašības, piemēram, šūnu paplašināšanās, diferenciācija, oksidatīvais stress un genoma stress. Uz CRISPR/Cas9 balstīta T šūnu skrīnings atklāja 25 dažādu T šūnu receptoru kināžu darbības traucējumus. Starp tām ir pierādīts, ka p38 kināzes dzēšana pastiprina T šūnu pretvēža aktivitāti, norādot, ka p38 kināze ir galvenais CAR-T šūnu regulācijas regulators (Gurusamy et al., 2020).
T šūnas var ģenētiski modificēt, izmantojot CRISPR/Cas9, lai iegūtu ļoti ekspresētas TCR. Ģenētiski modificētu T šūnu pārnešana pacientiem ir uzrādījusi spēcīgāku pretvēža aktivitāti nekā endogēnās T šūnas. Tādēļ endogēnās TCR var konkurēt ar ģenētiski modificētām TCR pacientiem, kas var ietekmēt vēža imunoterapijas potenciālu. Lai pārvarētu šo problēmu, izmantojot CRISPR/Cas9, lai noņemtu endogēno TCR-β recipienta šūnās un pēc tam pārnestu TCR-β T šūnas vēža pacientiem, var būt labākas pretvēža imūnās atbildes reakcijas bez nepieciešamības pēc endogēnas TCR seksuālās konkurences (Fan et al. 2018). Tādējādi, izņemot CRISPR modificētās T šūnas, TCR ir tūkstoš reižu jutīgākas pret audzēja antigēniem nekā normālas TCR transducētas T šūnas. Turklāt dažādās leikēmijās ar γδ TCR+ CRISPR ģenerētās izmainītās T šūnas uzrāda augstāku CD4+ un CD8+ T šūnu ekspresiju nekā standarta TCR pārnešana (Legut et al., 2018). Tādējādi ar CRISPR/Cas9 ģenerētās modificētās T šūnas var būt efektīva imunoterapijas metode, lai pārvarētu TNBC.
Integrīni ir šūnu adhēzijas molekulas, kas atrodas šūnu transmembrānās un veicina šūnu saistīšanos ar ārpusšūnu matricu (ECM) (Hamidi un Ivaska, 2018). Integrīnu disregulācija ir saistīta ar vēža attīstību un migrāciju, mainot ārpusšūnu matrici, kas noved pie vēža šūnu izdzīvošanas asinsritē (Hamidi un Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9 mediētā integrīnu ekspresijas nomākšana palēnina audzēja progresēšanu, metastāzes un kolonizāciju TNBC. Ir ziņots, ka integrīna α5 (ITGA5) ekspresijas nomākšana samazina šūnu migrāciju un progresēšanu citos vēža veidos, piemēram, plaušu vēzī (Ju et al., 2017), kas liecina, ka integrīns α5 var būt arī galvenais faktors TNBC patogenezē.
Izmantojot tradicionālās embrionālo cilmes šūnu (ES) metodes, izslēgšanas peļu ģenerēšana ir darbietilpīgs, laikietilpīgs un neefektīvs process. Lai mērķtiecīgi iedarbotos uz ES šūnām, izmantojot homologu rekombināciju, pavairotu himēriskas peles un pēc tam krustotu tās ar heterozigotām pelēm, lai iegūtu homozigotus pēcnācējus, nepieciešami mēneši un gadi. Lai radītu peles ar vairākām ģenētiskām mutācijām, ir nepieciešama sarežģīta krustošana. Tomēr, izmantojot peles, kas ģenerētas, ablējot ES šūnas, izmantojot CRISPR/Cas9, vai mikroinjicējot CRISPR/Cas9 komponentus vienas šūnas apaugļotās olšūnās, ir radušās daudzas problēmas. Piemēram, izmaiņu ieviešana bieži notiek bialēļu lokusos un nav gēnspecifiska. Nesen tika ziņots, ka ES šūnas, izmantojot CRISPR/Cas9 tehnoloģiju, var vienlaikus ievietot bialēļu mutācijas līdz pat 5 gēnos (Nishizono et al., 2021). Šim nolūkam Cas9 mRNS un piecas gēniem specifiskas gRNS tika vienlaikus transfektētas ES šūnās. Tas uzsver šīs procedūras daudzsološo raksturu un efektivitāti, lai gan šīs mutācijas, iespējams, tika nodotas tālāk, kad dibinātājlīnijas tika krustotas, lai iegūtu pieckāršas izslēgšanas peles. Pētījumā ziņots arī par pārsteidzošu atklājumu: ES šūnas vairs nav nepieciešamas, lai radītu ģenētiski modificētas peles. Tā vietā, lai noņemtu specifiskus gēnu produktus, vienšūnu stadijas embrijos tika ievadīta Cas9 mRNS un gRNS. Rezultātā ir izveidotas izslēgšanas dibinātājlīnijas, kuras teorētiski var izmantot, lai pētītu gēnu dzēšanas sekas pelēm (Qin et al., 2016). Tādējādi CRISPR/Cas9 ļauj izveidot transgēnas peles TNBC ārstēšanai par zemākām izmaksām nekā tradicionālā gēnu inženierija. Izmantojot CRISPR/Cas sistēmu, ir izstrādāts jauns izslēgšanas peles modelis, kas var veiksmīgi ieviest punktmutācijas vienā vai vairākos endogēnos gēnos TNBC. Pamatojoties uz šo koncepciju, TNBC dzīvnieku modeļus var izstrādāt arī, izmantojot CRISPR/Cas9 mediētu BRCA1 un p53 dzēšanu, kā rezultātā tiek zaudēta HR atjaunošana, rodas genoma nestabilitāte un mutantu fenotipi (Annunziato et al., 2020).
Pašlaik TNBC diagnosticēšanai tiek izmantotas dažādas metodes, piemēram, mamogrāfija, magnētiskās rezonanses attēlveidošana (MRI) un ultraskaņa. Tomēr šīm metodēm ir daži ierobežojumi. Mamogrāfija tiek izmantota lokālu krūts audu, nevis metastāžu diagnosticēšanai, kur vēža šūnas ir migrējušas uz citiem orgāniem. Ultrasonogrāfija nav uzticama metode TNBC diagnosticēšanai (Chen un Lee-Felker, 2023). MRI ir augstāka jutība nekā ultraskaņai un mamogrāfijai, taču tās diagnostiskā precizitāte ir ierobežota (Sha un Chen, 2022). Audu biopsija ir invazīva metode vēža šūnu identificēšanai. Tomēr dažos gadījumos biopsijā var nepamanīt vēža audus, ja adata novirzās no interesējošās zonas. Turklāt tā ir ļoti dārga un var būt traumatiska pacientam. TNBC ir heterogēns vēža veids, tāpēc biopsija var nesniegt pietiekamu informāciju par vēža veidu. Tāpēc steidzami nepieciešama jauna diagnostiski uzticama metode TNBC noteikšanai. CRISPR/Cas9 varētu kalpot kā ļoti jutīga un minimāli invazīva alternatīva krūts vēža diagnostikai. Šajā nolūkā CRISPR/Cas9 stratēģijas var izmantot, lai uzlabotu PCR metodes TNBC diagnostikā. Vispirms CRISPR sistēmas Cas9 un cpf1 proteīni tiek izmantoti, lai noņemtu nespecifisku DNS, un pēc tam šie divi proteīni (Cas9 un cpf1) var atpazīt PAM secību pirms saistīšanās ar mērķa DNS (Deepak Singh et al., 2021). Tādējādi PCR var identificēt mutācijas, kas saistītas ar vēža attīstību. Vairākos pētījumos ir izmantota šī CRISPR stratēģija, lai atklātu dažādas mutācijas dažādos vēža veidos (Safari et al., 2019). Tādējādi CRISPR balstītas PCR metodes var samazināt TNBC diagnostikas atkarību no invazīvām metodēm, piemēram, uz biopsiju balstītas imūnhistoķīmijas.
Arī TNBC ir pierādītas genotipiskas izmaiņas hormonu receptoru regulācijā (Chen un Russo, 2009). CRISPR/Cas9 balstītas PCR stratēģijas, izmantojot mikročipus diagnostikai aprūpes vietā, var efektīvi uzraudzīt šīs mutācijas (Hajian et al., 2019). Tas varētu arī sniegt veselības aprūpes sniedzējiem atbilstošu informāciju par specifiskām mutācijām TNBC pacientiem, kas varētu palīdzēt uzlabot viņu ārstēšanas kursu. Tomēr šai kombinētajai metodei ir ierobežojumi. Tāpēc, pirms šo CRISPR/Cas-PCR metodi var izmantot veselības aprūpē TNBC diagnosticēšanai, ir nepieciešami plaši pētījumi (Yang et al., 2019).