Ar datortomogrāfiju (CT) identificēto plaušu mezgliņu diferenciāldiagnoze joprojām ir izaicinājums klīniskajā praksē.Šeit mēs raksturojam 480 seruma paraugu globālo metabolomu, ieskaitot veselīgas kontroles, labdabīgus plaušu mezgliņus un I stadijas plaušu adenokarcinomu.Adenokarcinomām ir unikāli metabolomiski profili, savukārt labdabīgiem mezgliņiem un veseliem indivīdiem ir liela līdzība metabolomiskos profilos.Atklāšanas grupā (n = 306) tika identificēts 27 metabolītu kopums, lai atšķirtu labdabīgus un ļaundabīgus mezgliņus.Diskriminējošā modeļa AUC iekšējās validācijas (n = 104) un ārējās validācijas (n = 111) grupās bija attiecīgi 0,915 un 0,945.Ceļa analīze atklāja palielinātu glikolītisko metabolītu daudzumu, kas saistīts ar samazinātu triptofāna daudzumu plaušu adenokarcinomas serumā, salīdzinot ar labdabīgiem mezgliņiem un veselām kontrolēm, un ierosināja, ka triptofāna uzņemšana veicina glikolīzi plaušu vēža šūnās.Mūsu pētījums izceļ seruma metabolītu biomarķieru vērtību, novērtējot ar CT atklāto plaušu mezgliņu risku.
Agrīna diagnostika ir būtiska, lai uzlabotu vēža pacientu izdzīvošanas rādītājus.ASV Nacionālā plaušu vēža skrīninga izmēģinājuma (NLST) un Eiropas NELSON pētījuma rezultāti liecina, ka skrīnings ar mazas devas datortomogrāfiju (LDCT) var ievērojami samazināt plaušu vēža mirstību augsta riska grupās1,2,3.Kopš LDCT plašās izmantošanas plaušu vēža skrīningam, nejaušu asimptomātisku plaušu mezgliņu radiogrāfisko atradumu biežums ir turpinājis palielināties 4 .Plaušu mezgli ir definēti kā fokusa necaurredzamība līdz 3 cm diametrā 5 .Mums ir grūtības novērtēt ļaundabīgo audzēju iespējamību un tikt galā ar lielo plaušu mezgliņu skaitu, kas nejauši atklāti LDCT.DT ierobežojumi var izraisīt biežas novērošanas pārbaudes un kļūdaini pozitīvus rezultātus, izraisot nevajadzīgu iejaukšanos un pārmērīgu ārstēšanu6.Tāpēc ir jāizstrādā uzticami un noderīgi biomarķieri, lai pareizi identificētu plaušu vēzi agrīnās stadijās un atšķirtu lielāko daļu labdabīgo mezgliņu sākotnējās noteikšanas laikā 7 .
Visaptveroša asins (seruma, plazmas, perifēro asiņu mononukleāro šūnu) molekulārā analīze, tostarp genomika, proteomika vai DNS metilēšana 8, 9, 10, ir izraisījusi pieaugošu interesi par plaušu vēža diagnostisko biomarķieru atklāšanu.Tikmēr metabolomikas pieejas mēra šūnu galaproduktus, kurus ietekmē endogēnas un eksogēnas darbības, un tāpēc tiek izmantotas, lai prognozētu slimības sākšanos un iznākumu.Šķidruma hromatogrāfijas-tandēma masas spektrometrija (LC-MS) ir plaši izmantota metode metabolomikas pētījumos tās augstās jutības un lielā dinamiskā diapazona dēļ, kas var aptvert metabolītus ar dažādām fizikāli ķīmiskajām īpašībām11,12,13.Lai gan globālā plazmas/seruma metabolomiskā analīze ir izmantota, lai identificētu biomarķierus, kas saistīti ar plaušu vēža diagnozi 14, 15, 16, 17 un ārstēšanas efektivitāti,18 seruma metabolītu klasifikatori, lai atšķirtu labdabīgus un ļaundabīgus plaušu mezgliņus, joprojām ir daudz pētīti.- masveida pētījumi.
Adenokarcinoma un plakanšūnu karcinoma ir divi galvenie nesīkšūnu plaušu vēža (NSCLC) apakštipi.Dažādi CT skrīninga testi liecina, ka adenokarcinoma ir visizplatītākais plaušu vēža histoloģiskais veids1,19,20,21.Šajā pētījumā mēs izmantojām īpaši veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas augstas izšķirtspējas masas spektrometriju (UPLC-HRMS), lai veiktu metabolomikas analīzi kopumā 695 seruma paraugos, ieskaitot veselus kontroles, labdabīgus plaušu mezgliņus un CT noteiktos ≤3 cm.I stadijas plaušu adenokarcinomas skrīnings.Mēs identificējām seruma metabolītu paneli, kas atšķir plaušu adenokarcinomu no labdabīgiem mezgliņiem un veselīgām kontrolēm.Ceļa bagātināšanas analīze atklāja, ka patoloģiska triptofāna un glikozes metabolisms ir izplatītas plaušu adenokarcinomas izmaiņas, salīdzinot ar labdabīgiem mezgliņiem un veselām kontrolēm.Visbeidzot, mēs izveidojām un apstiprinājām seruma metabolisma klasifikatoru ar augstu specifiskumu un jutīgumu, lai atšķirtu ļaundabīgos un labdabīgos plaušu mezgliņus, ko atklāj LDCT, kas var palīdzēt agrīnā diferenciāldiagnozē un riska novērtēšanā.
Pašreizējā pētījumā dzimuma un vecuma seruma paraugi tika retrospektīvi savākti no 174 veselām kontrolēm, 292 pacientiem ar labdabīgiem plaušu mezgliņiem un 229 pacientiem ar I stadijas plaušu adenokarcinomu.695 subjektu demogrāfiskie raksturlielumi ir parādīti 1. papildu tabulā.
Kā parādīts 1.a attēlā, Sun Yat-sen universitātes vēža centrā tika savākti kopumā 480 seruma paraugi, tostarp 174 veselīgas kontroles (HC), 170 labdabīgi mezgliņi (BN) un 136 I stadijas plaušu adenokarcinomas (LA) paraugi.Atklāšanas kohorta nemērķtiecīgai metabolomiskai profilēšanai, izmantojot īpaši augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas masas spektrometriju (UPLC-HRMS).Kā parādīts 1. papildu attēlā, tika identificēti atšķirīgi metabolīti starp LA un HC, LA un BN, lai izveidotu klasifikācijas modeli un turpinātu pētīt diferenciālo ceļu analīzi.104 paraugi, kas savākti Sun Yat-sen universitātes vēža centrā, un 111 paraugi, kas savākti divās citās slimnīcās, tika pakļauti attiecīgi iekšējai un ārējai validācijai.
Pētījuma populācija atklājumu grupā, kurai tika veikta globālā seruma metabolomikas analīze, izmantojot īpaši veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas augstas izšķirtspējas masas spektrometriju (UPLC-HRMS).b Daļēji mazāko kvadrātu diskriminējošās analīzes (PLS-DA) kopējā metabolomā no 480 seruma paraugiem no pētījuma kohortas, ieskaitot veselas kontroles (HC, n = 174), labdabīgus mezgliņus (BN, n = 170) un I stadijas plaušu adenokarcinomu. (Losandželosa, n = 136).+ESI, pozitīvs elektrosmidzināšanas jonizācijas režīms, -ESI, negatīvs elektrosmidzināšanas jonizācijas režīms.c–e Metabolīti ar ievērojami atšķirīgu daudzumu divās noteiktās grupās (divu zaru Vilkoksona parakstītais ranga tests, kļūdaini atklāšanas ātruma koriģētā p vērtība, FDR <0,05) ir parādīti sarkanā krāsā (izmaiņas reizēs > 1,2) un zilā krāsā (reizes izmaiņas < 0,83). .), kas parādīts vulkāna grafikā.f Hierarhiskā klasterizācijas siltuma karte, kas parāda būtiskas atšķirības anotēto metabolītu skaitā starp LA un BN.Avota dati tiek sniegti avota datu failu veidā.
Kopējais seruma metaboloms 174 HC, 170 BN un 136 LA atklāšanas grupā tika analizēts, izmantojot UPLC-HRMS analīzi.Vispirms mēs parādām, ka kvalitātes kontroles (QC) paraugi cieši sagrupējas nepārraudzīta galveno komponentu analīzes (PCA) modeļa centrā, apstiprinot pašreizējā pētījuma veiktspējas stabilitāti (2. papildu attēls).
Kā parādīts daļējo mazāko kvadrātu diskriminācijas analīzē (PLS-DA) 1.b attēlā, mēs atklājām, ka pastāv skaidras atšķirības starp LA un BN, LA un HC pozitīvajos (+ESI) un negatīvajos (-ESI) elektrosmidzināšanas jonizācijas režīmos. .izolēts.Tomēr būtiskas atšķirības starp BN un HC netika konstatētas +ESI un -ESI apstākļos.
Mēs atradām 382 atšķirības starp LA un HC, 231 diferenciālo pazīmi starp LA un BN un 95 diferenciālās pazīmes starp BN un HC (Vilkoksona paraksta ranga tests, FDR <0,05 un vairāku izmaiņu > 1,2 vai <0,83) (attēls .1c-e )..Pīķi tika tālāk anotēti (3. papildu dati) attiecībā pret datubāzi (mzCloud/HMDB/Chemspider bibliotēka) pēc m/z vērtības, aiztures laika un fragmentācijas masas spektra meklēšanas (sīkāka informācija aprakstīta sadaļā Metodes) 22 .Visbeidzot, attiecīgi LA un BN tika identificēti 33 un 38 anotēti metabolīti ar būtiskām pārpilnības atšķirībām (1.f attēls un 2. papildu tabula) un LA un HC (3. papildu attēls un 2. papildu tabula).Turpretim BN un HC tika identificēti tikai 3 metabolīti ar būtiskām atšķirībām pārpilnībā (2. papildu tabula), kas atbilst BN un HC pārklāšanai PLS-DA.Šie atšķirīgie metabolīti aptver plašu bioķīmisko vielu klāstu (4. papildu attēls).Kopumā šie rezultāti parāda būtiskas izmaiņas seruma metabolomā, kas atspoguļo agrīnas stadijas plaušu vēža ļaundabīgu transformāciju, salīdzinot ar labdabīgiem plaušu mezgliņiem vai veseliem cilvēkiem.Tikmēr BN un HC seruma metabolomu līdzība liecina, ka labdabīgiem plaušu mezgliņiem var būt daudzas bioloģiskas īpašības ar veseliem indivīdiem.Ņemot vērā, ka epidermas augšanas faktora receptoru (EGFR) gēnu mutācijas ir izplatītas plaušu adenokarcinomas apakštipā 23, mēs centāmies noteikt vadītāja mutāciju ietekmi uz seruma metabolomu.Pēc tam mēs analizējām kopējo metabolomisko profilu 72 gadījumos ar EGFR statusu plaušu adenokarcinomas grupā.Interesanti, ka PCA analīzē mēs atradām salīdzināmus profilus starp EGFR mutantu pacientiem (n = 41) un EGFR savvaļas tipa pacientiem (n = 31) (papildu attēls 5a).Tomēr mēs identificējām 7 metabolītus, kuru pārpilnība bija ievērojami mainījusies pacientiem ar EGFR mutāciju, salīdzinot ar pacientiem ar savvaļas tipa EGFR (t tests, p < 0, 05 un reizes izmaiņas > 1, 2 vai < 0, 83) (papildu attēls 5b).Lielākā daļa šo metabolītu (5 no 7) ir acilkarnitīni, kuriem ir svarīga loma taukskābju oksidācijas ceļos.
Kā parādīts 2.a attēlā parādītajā darbplūsmā, biomarķieri mezgliņu klasifikācijai tika iegūti, izmantojot vismazākās absolūtās saraušanās operatorus un atlasi, pamatojoties uz 33 diferenciāliem metabolītiem, kas identificēti LA (n = 136) un BN (n = 170).Labākā mainīgo kombinācija (LASSO) – binārās loģistikas regresijas modelis.Lai pārbaudītu modeļa uzticamību, tika izmantota desmitkārtīga savstarpēja validācija.Mainīgo atlasi un parametru regularizāciju koriģē ar varbūtības maksimizēšanas sodu ar parametru λ24.Globālā metabolomikas analīze tālāk tika veikta neatkarīgi iekšējās validācijas (n = 104) un ārējās validācijas (n = 111) grupās, lai pārbaudītu diskriminējošā modeļa klasifikācijas veiktspēju.Rezultātā 27 metabolīti atklājumu komplektā tika identificēti kā labākais diskriminējošais modelis ar lielāko vidējo AUC vērtību (2.b att.), no kuriem 9 bija palielināta aktivitāte un 18 samazināta aktivitāte LA, salīdzinot ar BN (2.c attēls).
Plaušu mezglu klasifikatora izveides darbplūsma, tostarp labākā seruma metabolītu paneļa atlase atklāšanas komplektā, izmantojot bināro loģistiskās regresijas modeli, izmantojot desmitkārtīgu savstarpēju validāciju, un paredzamās veiktspējas novērtēšana iekšējās un ārējās validācijas kopās.b LASSO regresijas modeļa savstarpējās validācijas statistika vielmaiņas biomarķieru atlasei.Iepriekš norādītie skaitļi atspoguļo vidējo biomarķieru skaitu, kas atlasīti noteiktā λ.Sarkanā punktētā līnija apzīmē vidējo AUC vērtību pie atbilstošās lambda.Pelēkas kļūdu joslas attēlo minimālās un maksimālās AUC vērtības.Punktētā līnija norāda labāko modeli ar 27 atlasītajiem biomarķieriem.AUC, laukums zem uztvērēja darbības raksturlīknes (ROC).c 27 atlasīto metabolītu izmaiņas LA grupā, salīdzinot ar BN grupu atklāšanas grupā.Sarkanā kolonna – aktivizācija.Zilā kolonna ir lejupslīde.d–f Uztvērēja darbības raksturlielumu (ROC) līknes, kas parāda diskriminējošā modeļa jaudu, pamatojoties uz 27 metabolītu kombinācijām atklāšanas, iekšējās un ārējās validācijas kopās.Avota dati tiek sniegti avota datu failu veidā.
Tika izveidots prognozēšanas modelis, pamatojoties uz šo 27 metabolītu svērtajiem regresijas koeficientiem (3. papildu tabula).ROC analīze, kas balstīta uz šiem 27 metabolītiem, deva laukumu zem līknes (AUC) vērtību 0,933, atklāšanas grupas jutīgums bija 0,868 un specifiskums bija 0,859 (2.d attēls).Tikmēr starp 38 anotētajiem atšķirīgajiem metabolītiem starp LA un HC 16 metabolītu komplekts sasniedza AUC 0, 902 ar jutīgumu 0, 801 un specifiskumu 0, 856, atšķirot LA no HC (papildu attēls 6a-c).Tika salīdzinātas arī AUC vērtības, kas balstītas uz dažādiem metabolītu izmaiņu sliekšņiem.Mēs noskaidrojām, ka klasifikācijas modelis vislabāk darbojās, lai atšķirtu LA un BN (HC), kad locījuma izmaiņu līmenis bija iestatīts uz 1, 2 pret 1, 5 vai 2, 0 (papildu attēls 7a, b).Klasifikācijas modelis, kas balstīts uz 27 metabolītu grupām, tika tālāk apstiprināts iekšējās un ārējās grupās.AUC bija 0,915 (jutība 0,867, specifiskums 0,811) iekšējai validācijai un 0,945 (jutība 0,810, specifiskums 0,979) ārējai validācijai (2.e, f attēls).Lai novērtētu starplaboratoriju efektivitāti, ārējā laboratorijā tika analizēti 40 paraugi no ārējās kohortas, kā aprakstīts sadaļā Metodes.Klasifikācijas precizitāte sasniedza AUC 0,925 (8. papildu attēls).Tā kā plaušu plakanšūnu karcinoma (LUSC) ir otrs visizplatītākais nesīkšūnu plaušu vēža (NSCLC) apakštips pēc plaušu adenokarcinomas (LUAD), mēs arī pārbaudījām vielmaiņas profilu apstiprināto iespējamo lietderību.BN un 16 LUSC gadījumi.Diskriminācijas AUC starp LUSC un BN bija 0, 776 (9. papildu attēls), kas liecina par sliktāku spēju salīdzinājumā ar diskrimināciju starp LUAD un BN.
Pētījumi ir parādījuši, ka mezgliņu izmērs CT attēlos ir pozitīvi korelēts ar ļaundabīgo audzēju iespējamību un joprojām ir galvenais mezglu ārstēšanas noteicošais faktors25, 26, 27.Datu analīze no lielas NELSON skrīninga pētījuma grupas parādīja, ka ļaundabīgo audzēju risks subjektiem ar mezgliem <5 mm bija pat līdzīgs kā subjektiem bez mezgliem28.Tāpēc minimālais izmērs, kam nepieciešama regulāra CT uzraudzība, ir 5 mm, kā ieteikusi Britu krūškurvja biedrība (BTS), un 6 mm, kā ieteikusi Fleišnera biedrība 29 .Tomēr mezgli, kas ir lielāki par 6 mm un bez acīmredzamām labdabīgām pazīmēm, ko sauc par nenoteiktiem plaušu mezgliem (IPN), joprojām ir galvenais izaicinājums novērtēšanā un pārvaldībā klīniskajā praksē30, 31.Pēc tam mēs pārbaudījām, vai mezgla lielums ietekmēja metabolomiskos parakstus, izmantojot apvienotos paraugus no atklāšanas un iekšējās validācijas grupām.Koncentrējoties uz 27 apstiprinātiem biomarķieriem, mēs vispirms salīdzinājām HC un BN sub-6 mm metabolomu PCA profilus.Mēs atklājām, ka lielākā daļa HC un BN datu punktu pārklājās, parādot, ka seruma metabolītu līmenis abās grupās bija līdzīgs (3.a attēls).Iezīmju kartes dažādos izmēru diapazonos saglabājās BN un LA (3.b, c att.), turpretim tika novērota atdalīšana starp ļaundabīgiem un labdabīgiem mezgliņiem 6–20 mm diapazonā (3.d att.).Šīs kohortas AUC bija 0,927, specifiskums 0,868 un jutība 0,820, lai prognozētu 6 līdz 20 mm lielu mezgliņu ļaundabīgo audzēju (3.e, f attēls).Mūsu rezultāti liecina, ka klasifikators var uztvert vielmaiņas izmaiņas, ko izraisa agrīna ļaundabīga transformācija, neatkarīgi no mezgla lieluma.
ad PCA profilu salīdzinājums starp noteiktām grupām, pamatojoties uz 27 metabolītu metabolisma klasifikatoru.CC un BN < 6 mm.b BN < 6 mm pret BN 6–20 mm.LA 6–20 mm pret LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm un LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Uztvērēja darbības raksturlielumu (ROC) līkne, kas parāda diskriminējošā modeļa veiktspēju mezgliem 6–20 mm.f Varbūtības vērtības tika aprēķinātas, pamatojoties uz loģistikas regresijas modeli mezgliņiem, kuru izmērs ir 6–20 mm.Pelēkā punktētā līnija apzīmē optimālo robežvērtību (0,455).Iepriekš minētie skaitļi atspoguļo Losandželosai paredzēto gadījumu procentuālo daļu.Izmantojiet divpusējo Studenta t testu.PCA, galveno komponentu analīze.AUC laukums zem līknes.Avota dati tiek sniegti avota datu failu veidā.
Tālāk tika atlasīti četri paraugi (vecumā no 44 līdz 61 gadam) ar līdzīgiem plaušu mezglu izmēriem (7–9 mm), lai ilustrētu piedāvātā ļaundabīgo audzēju prognozēšanas modeļa veiktspēju (4.a, b att.).Sākotnējā skrīningā 1. gadījums tika parādīts kā ciets mezgliņš ar pārkaļķošanos, kas ir pazīme, kas saistīta ar labdabīgumu, savukārt 2. gadījums tika parādīts kā nenoteikts daļēji ciets mezgls bez acīmredzamām labdabīgām pazīmēm.Trīs pēcpārbaudes CT skenēšanas kārtas parādīja, ka šie gadījumi saglabājās stabili 4 gadu periodā un tāpēc tika uzskatīti par labdabīgiem mezgliņiem (4.a attēls).Salīdzinot ar sērijveida CT skenēšanas klīnisko novērtējumu, viena šāviena seruma metabolītu analīze ar pašreizējo klasifikatora modeli ātri un pareizi identificēja šos labdabīgos mezgliņus, pamatojoties uz varbūtības ierobežojumiem (1.4.b attēlā 3. gadījumā redzams mezgls ar pleiras ievilkšanas pazīmēm, kas visbiežāk ir saistītas ar ļaundabīgu audzēju32.4. gadījums tika parādīts kā nenoteikts, daļēji ciets mezgliņš bez labdabīga iemesla pazīmēm.Visi šie gadījumi tika prognozēti kā ļaundabīgi saskaņā ar klasifikatora modeli (1. tabula).Plaušu adenokarcinomas novērtējums tika pierādīts ar histopatoloģisko izmeklēšanu pēc plaušu rezekcijas operācijas (4.b att.).Ārējai validācijas komplektam vielmaiņas klasifikators precīzi paredzēja divus nenoteiktu plaušu mezgliņu gadījumus, kas lielāki par 6 mm (10. papildu attēls).
Divu labdabīgu mezglu gadījumu plaušu aksiālā loga CT attēli.1. gadījumā CT skenēšana pēc 4 gadiem uzrādīja stabilu cietu mezglu ar izmēru 7 mm ar kalcifikāciju labajā apakšējā daivā.2. gadījumā CT skenēšana pēc 5 gadiem atklāja stabilu, daļēji cietu mezglu ar 7 mm diametru labajā augšējā daivā.b Plaušu aksiālā loga CT attēli un atbilstošie patoloģiskie pētījumi diviem I stadijas adenokarcinomas gadījumiem pirms plaušu rezekcijas.3. gadījumā tika atklāts mezgls ar 8 mm diametru labajā augšējā daivā ar pleiras ievilkšanu.4. gadījums atklāja daļēji cietu pieslīpētu stikla mezgliņu, kura izmērs bija 9 mm kreisajā augšējā daivā.Izdalīto plaušu audu hematoksilīna un eozīna (H&E) krāsošana (mēroga josla = 50 μm), kas parāda plaušu adenokarcinomas acināro augšanas modeli.Bultiņas norāda uz CT attēlos konstatētajiem mezgliņiem.H&E attēli ir reprezentatīvi attēli no vairākiem (> 3) mikroskopiskiem laukiem, ko pārbaudījis patologs.
Kopumā mūsu rezultāti parāda seruma metabolītu biomarķieru iespējamo vērtību plaušu mezgliņu diferenciāldiagnozē, kas var radīt problēmas, novērtējot CT skrīningu.
Pamatojoties uz apstiprinātu diferenciālo metabolītu paneli, mēs centāmies noteikt galveno metabolisma izmaiņu bioloģiskās korelācijas.KEGG ceļa bagātināšanas analīze, ko veica MetaboAnalyst, identificēja 6 bieži sastopamus, būtiski izmainītus ceļus starp abām grupām (LA pret HC un LA pret BN, koriģēts p ≤ 0,001, efekts > 0,01).Šīs izmaiņas raksturoja piruvāta metabolisma, triptofāna metabolisma, niacīna un nikotīnamīda metabolisma, glikolīzes, TCA cikla un purīna metabolisma traucējumi (5.a attēls).Pēc tam mēs turpinājām veikt mērķtiecīgu metabolomiku, lai pārbaudītu galvenās izmaiņas, izmantojot absolūto kvantitatīvo noteikšanu.Kopējo metabolītu noteikšana parasti mainītos ceļos ar trīskāršās kvadrupola masas spektrometriju (QQQ), izmantojot autentiskus metabolītu standartus.Metabolomikas pētījuma mērķa parauga demogrāfiskie raksturlielumi ir iekļauti 4. papildu tabulā. Saskaņā ar mūsu globālajiem metabolomikas rezultātiem kvantitatīvā analīze apstiprināja, ka hipoksantīna un ksantīna, piruvāta un laktāta līmenis LA tika palielināts salīdzinājumā ar BN un HC (5.b, c att., p <0,05).Tomēr būtiskas atšķirības šajos metabolītos starp BN un HC netika konstatētas.
KEGG ceļa bagātināšanas analīze ievērojami atšķirīgiem metabolītiem LA grupā, salīdzinot ar BN un HC grupām.Tika izmantots divpusējs globālais tests, un p vērtības tika koriģētas, izmantojot Holm-Bonferroni metodi (koriģēts p ≤ 0,001 un efekta lielums > 0,01).b–d Vijoles diagrammas, kas parāda hipoksantīna, ksantīna, laktāta, piruvāta un triptofāna līmeni seruma HC, BN un LA, ko nosaka ar LC-MS/MS (n = 70 katrā grupā).Baltas un melnas punktētas līnijas norāda attiecīgi vidējo un kvartili.e Vijoles diagramma, kurā parādīta SLC7A5 un QPRT normalizēta Log2TPM (transkripti uz miljonu) mRNS ekspresija plaušu adenokarcinomas gadījumā (n = 513), salīdzinot ar normāliem plaušu audiem (n = 59) LUAD-TCGA datu kopā.Baltais lodziņš apzīmē starpkvartiļu diapazonu, horizontālā melnā līnija centrā apzīmē mediānu, un vertikālā melnā līnija, kas stiepjas no lodziņa, apzīmē 95% ticamības intervālu (TI).f SLC7A5 un GAPDH ekspresijas Pīrsona korelācijas diagramma plaušu adenokarcinomas gadījumā (n = 513) un normālos plaušu audos (n = 59) TCGA datu kopā.Pelēkā zona apzīmē 95% TI.r, Pīrsona korelācijas koeficients.g Normalizēts šūnu triptofāna līmenis A549 šūnās, kas transficētas ar nespecifisku shRNS kontroli (NC) un shSLC7A5 (Sh1, Sh2), ko nosaka LC-MS/MS.Tiek prezentēta piecu bioloģiski neatkarīgu paraugu statistiskā analīze katrā grupā.h NADt līmenis šūnās (kopējais NAD, ieskaitot NAD+ un NADH) A549 šūnās (NC) un SLC7A5 notriektajās A549 šūnās (Sh1, Sh2).Tiek prezentēta trīs bioloģiski neatkarīgu paraugu statistiskā analīze katrā grupā.i A549 šūnu glikolītiskā aktivitāte pirms un pēc SLC7A5 notriekšanas tika mērīta ar ekstracelulārās paskābināšanās ātrumu (ECAR) (n = 4 bioloģiski neatkarīgi paraugi katrā grupā).2-DG,2-deoksi-D-glikoze.Divpusējs Studenta t tests tika izmantots (b–h).(g – i) kļūdu joslas attēlo vidējo ± SD, katrs eksperiments tika veikts trīs reizes neatkarīgi, un rezultāti bija līdzīgi.Avota dati tiek sniegti avota datu failu veidā.
Ņemot vērā izmainītā triptofāna metabolisma nozīmīgo ietekmi LA grupā, mēs arī novērtējām triptofāna līmeni serumā HC, BN un LA grupās, izmantojot QQQ.Mēs atklājām, ka seruma triptofāna līmenis LA tika samazināts, salīdzinot ar HC vai BN (p < 0,001, 5.d attēls), kas atbilst iepriekšējiem atklājumiem, ka cirkulējošā triptofāna līmenis pacientiem ar plaušu vēzi ir zemāks nekā veseliem kontroles grupas dalībniekiem33, 34. ,35.Citā pētījumā, kurā tika izmantots PET/CT marķieris 11C-metil-L-triptofāns, atklājās, ka triptofāna signāla aiztures laiks plaušu vēža audos ir ievērojami palielināts, salīdzinot ar labdabīgiem bojājumiem vai normāliem audiem36.Mēs izvirzām hipotēzi, ka triptofāna samazināšanās LA serumā var atspoguļot plaušu vēža šūnu aktīvo triptofāna uzņemšanu.
Ir arī zināms, ka triptofāna katabolisma kinurenīna ceļa galaprodukts ir NAD+37,38, kas ir svarīgs substrāts gliceraldehīda-3-fosfāta reakcijai ar 1,3-bisfosfoglicerātu glikolīzē39.Lai gan iepriekšējie pētījumi ir vērsti uz triptofāna katabolisma lomu imūnsistēmas regulēšanā, mēs centāmies noskaidrot mijiedarbību starp triptofāna disregulāciju un glikolītiskajiem ceļiem, kas novēroti pašreizējā pētījumā.Ir zināms, ka 7. grupas 5. loceklis (SLC7A5) ir triptofāna transportētājs43,44,45.Hinolīnskābes fosforiboziltransferāze (QPRT) ir enzīms, kas atrodas lejpus kinurenīna ceļa, kas pārvērš hinolīnskābi par NAMN46.Pārbaudot LUAD TCGA datu kopu, atklājās, ka gan SLC7A5, gan QPRT audzēja audos bija ievērojami paaugstināti, salīdzinot ar normāliem audiem (5.e attēls).Šis pieaugums tika novērots plaušu adenokarcinomas I un II stadijā, kā arī III un IV stadijā (papildu attēls 11), kas norāda uz agrīniem triptofāna metabolisma traucējumiem, kas saistīti ar audzēja ģenēzi.
Turklāt LUAD-TCGA datu kopa uzrādīja pozitīvu korelāciju starp SLC7A5 un GAPDH mRNS ekspresiju vēža pacientu paraugos (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5.f attēls).Turpretim netika konstatēta būtiska korelācija starp šādiem gēnu parakstiem normālos plaušu audos (r = 0,25, p = 0,06, 5.f attēls).SLC7A5 iznīcināšana (12. papildu attēls) A549 šūnās ievērojami samazināja šūnu triptofāna un NAD(H) līmeni (5g, h attēls), kā rezultātā tika vājināta glikolītiskā aktivitāte, ko mēra ar ārpusšūnu paskābināšanās ātrumu (ECAR) (1. attēls).5i).Tādējādi, pamatojoties uz metabolisma izmaiņām serumā un in vitro noteikšanu, mēs izvirzām hipotēzi, ka triptofāna metabolisms var radīt NAD + caur kinurenīna ceļu un tam ir svarīga loma glikolīzes veicināšanā plaušu vēža gadījumā.
Pētījumi ir parādījuši, ka liels skaits nenoteiktu plaušu mezgliņu, kas atklāti ar LDCT, var izraisīt nepieciešamību veikt papildu pārbaudes, piemēram, PET-CT, plaušu biopsiju un pārmērīgu ārstēšanu, jo ir kļūdaini pozitīva ļaundabīga audzēja diagnoze.31 Kā parādīts 6. attēlā, mūsu pētījumā tika identificēts seruma metabolītu panelis ar potenciālu diagnostisko vērtību, kas var uzlabot riska noslāņošanos un turpmāko CT atklāto plaušu mezgliņu pārvaldību.
Plaušu mezgliņus novērtē, izmantojot mazas devas datortomogrāfiju (LDCT) ar attēlveidošanas pazīmēm, kas liecina par labdabīgiem vai ļaundabīgiem cēloņiem.Neskaidrs mezgliņu iznākums var izraisīt biežus novērošanas apmeklējumus, nevajadzīgas iejaukšanās un pārmērīgu ārstēšanu.Seruma vielmaiņas klasifikatoru ar diagnostisko vērtību iekļaušana var uzlabot riska novērtējumu un turpmāku plaušu mezgliņu pārvaldību.PET pozitronu emisijas tomogrāfija.
ASV NLST pētījuma un Eiropas NELSON pētījuma dati liecina, ka augsta riska grupu skrīnings ar mazas devas datortomogrāfiju (LDCT) var samazināt mirstību no plaušu vēža1,3.Tomēr LDCT atklāto liela skaita nejaušu plaušu mezgliņu riska novērtējums un turpmākā klīniskā vadība joprojām ir vissarežģītākā problēma.Galvenais mērķis ir optimizēt pareizo esošo LDCT balstītu protokolu klasifikāciju, iekļaujot uzticamus biomarķierus.
Atsevišķi molekulāri biomarķieri, piemēram, asins metabolīti, ir identificēti, salīdzinot plaušu vēzi ar veselām kontrolēm15, 17.Šajā pētījumā mēs koncentrējāmies uz seruma metabolomikas analīzes izmantošanu, lai atšķirtu labdabīgus un ļaundabīgus plaušu mezglus, ko nejauši atklāja LDCT.Mēs salīdzinājām veselīgas kontroles (HC), labdabīgu plaušu mezgliņu (BN) un I stadijas plaušu adenokarcinomas (LA) paraugu globālo seruma metabolomu, izmantojot UPLC-HRMS analīzi.Mēs noskaidrojām, ka HC un BN bija līdzīgi vielmaiņas profili, bet LA uzrādīja būtiskas izmaiņas salīdzinājumā ar HC un BN.Mēs identificējām divus seruma metabolītu komplektus, kas atšķir LA no HC un BN.
Pašreizējā uz LDCT balstītā labdabīgu un ļaundabīgu mezgliņu identifikācijas shēma galvenokārt balstās uz mezglu izmēru, blīvumu, morfoloģiju un augšanas ātrumu laika gaitā30.Iepriekšējie pētījumi liecina, ka mezgliņu lielums ir cieši saistīts ar plaušu vēža iespējamību.Pat augsta riska pacientiem ļaundabīgo audzēju risks mezglos <6 mm ir <1%.Ļaundabīgo audzēju risks mezgliņiem ar izmēru 6 līdz 20 mm svārstās no 8% līdz 64%30.Tāpēc Fleišnera biedrība ikdienas CT novērošanai iesaka 6 mm robeždiametru.29 Tomēr nenoteiktu plaušu mezgliņu (IPN), kas lielāki par 6 mm, riska novērtējums un pārvaldība nav pienācīgi veikta31.Pašreizējā iedzimtu sirds slimību ārstēšana parasti balstās uz uzmanīgu gaidīšanu ar biežu CT uzraudzību.
Pamatojoties uz apstiprināto metabolomu, mēs pirmo reizi parādījām metabolomisko parakstu pārklāšanos starp veseliem indivīdiem un labdabīgiem mezgliņiem, kuru izmērs ir <6 mm.Bioloģiskā līdzība atbilst iepriekšējiem CT atklājumiem, ka ļaundabīgo audzēju risks mezgliem <6 mm ir tikpat zems kā subjektiem bez mezgliem.30 Jāņem vērā, ka mūsu rezultāti arī parāda, ka labdabīgiem mezgliem <6 mm un ≥6 mm ir augsts. Metabolisma profilu līdzība, kas liecina, ka labdabīgas etioloģijas funkcionālā definīcija ir konsekventa neatkarīgi no mezgla lieluma.Tādējādi mūsdienu diagnostikas seruma metabolītu paneļi var nodrošināt vienu testu kā izslēgšanas testu, kad mezgli sākotnēji tiek atklāti CT un, iespējams, samazina sērijveida uzraudzību.Tajā pašā laikā tas pats vielmaiņas biomarķieru panelis atšķīra ļaundabīgus mezgliņus, kuru izmērs bija ≥6 mm, no labdabīgiem mezgliem un sniedza precīzas prognozes par līdzīga izmēra IPN un neskaidrām morfoloģiskām iezīmēm CT attēlos.Šis seruma metabolisma klasifikators labi darbojās, prognozējot ≥6 mm lielu mezgliņu ļaundabīgo audzēju ar AUC 0,927.Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka unikālie seruma metabolomiskie paraksti var īpaši atspoguļot agrīnas audzēja izraisītas vielmaiņas izmaiņas un tiem ir potenciāla vērtība kā riska prognozētāji neatkarīgi no mezgla lieluma.
Jo īpaši plaušu adenokarcinoma (LUAD) un plakanšūnu karcinoma (LUSC) ir galvenie nesīkšūnu plaušu vēža (NSCLC) veidi.Ņemot vērā, ka LUSC ir cieši saistīts ar tabakas lietošanu47 un LUAD ir visizplatītākā nejaušu plaušu mezgliņu histoloģija, kas atklāta CT skrīningā48, mūsu klasifikatora modelis tika īpaši izveidots I stadijas adenokarcinomas paraugiem.Vangs un kolēģi koncentrējās arī uz LUAD un identificēja deviņus lipīdu parakstus, izmantojot lipidomiku, lai atšķirtu agrīnās stadijas plaušu vēzi no veseliem indivīdiem17.Mēs pārbaudījām pašreizējo klasifikatora modeli 16 I stadijas LUSC gadījumos un 74 labdabīgiem mezgliņiem un novērojām zemu LUSC prognozēšanas precizitāti (AUC 0, 776), kas liecina, ka LUAD un LUSC var būt savi metabolomiski paraksti.Patiešām, ir pierādīts, ka LUAD un LUSC atšķiras etioloģijas, bioloģiskās izcelsmes un ģenētisko aberāciju ziņā49.Tāpēc citi histoloģijas veidi ir jāiekļauj apmācības modeļos plaušu vēža noteikšanai skrīninga programmās.
Šeit mēs noteicām sešus visbiežāk mainītos plaušu adenokarcinomas ceļus, salīdzinot ar veselām kontrolēm un labdabīgiem mezgliņiem.Ksantīns un hipoksantīns ir bieži sastopami purīna metabolisma ceļa metabolīti.Saskaņā ar mūsu rezultātiem starpprodukti, kas saistīti ar purīna metabolismu, ievērojami palielinājās pacientu ar plaušu adenokarcinomu serumā vai audos, salīdzinot ar veselām kontrolēm vai pacientiem preinvazīvā stadijā15, 50.Paaugstināts ksantīna un hipoksantīna līmenis serumā var atspoguļot anabolismu, kas nepieciešams strauji proliferējošām vēža šūnām.Glikozes metabolisma disregulācija ir labi zināma vēža metabolisma pazīme51.Šeit mēs novērojām ievērojamu piruvāta un laktāta pieaugumu LA grupā, salīdzinot ar HC un BN grupu, kas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem par glikolītiskā ceļa anomālijām nesīkšūnu plaušu vēža (NSCLC) pacientu seruma metabolomu profilos un veselīgas kontroles.rezultāti ir konsekventi52,53.
Svarīgi, ka mēs novērojām apgrieztu korelāciju starp piruvāta un triptofāna metabolismu plaušu adenokarcinomu serumā.Seruma triptofāna līmenis LA grupā tika samazināts, salīdzinot ar HC vai BN grupu.Interesanti, ka iepriekšējā liela mēroga pētījumā, kurā tika izmantota iespējamā kohorta, tika atklāts, ka zems cirkulējošā triptofāna līmenis ir saistīts ar paaugstinātu plaušu vēža risku54.Triptofāns ir neaizstājama aminoskābe, ko mēs pilnībā iegūstam ar pārtiku.Mēs secinām, ka seruma triptofāna samazināšanās plaušu adenokarcinomas gadījumā var atspoguļot šī metabolīta ātru samazināšanos.Ir labi zināms, ka triptofāna katabolisma galaprodukts caur kinurenīna ceļu ir de novo NAD+ sintēzes avots.Tā kā NAD+ tiek ražots galvenokārt glābšanas ceļā, vēl ir jānosaka NAD+ nozīme triptofāna metabolismā veselības un slimību gadījumā46.Mūsu TCGA datu bāzes analīze parādīja, ka triptofāna transportētāja izšķīdušās vielas transportētāja 7A5 (SLC7A5) ekspresija bija ievērojami palielināta plaušu adenokarcinomas gadījumā, salīdzinot ar normālu kontroli, un tā bija pozitīvi korelēta ar glikolītiskā enzīma GAPDH ekspresiju.Iepriekšējie pētījumi galvenokārt ir vērsti uz triptofāna katabolisma lomu pretvēža imūnās atbildes nomākšanā 40, 41, 42.Šeit mēs parādām, ka triptofāna uzņemšanas kavēšana, iznīcinot SLC7A5 plaušu vēža šūnās, izraisa sekojošu šūnu NAD līmeņa pazemināšanos un vienlaicīgu glikolītiskās aktivitātes pavājināšanos.Rezumējot, mūsu pētījums nodrošina bioloģisku pamatu seruma metabolisma izmaiņām, kas saistītas ar plaušu adenokarcinomas ļaundabīgu transformāciju.
EGFR mutācijas ir visizplatītākās izraisītāja mutācijas pacientiem ar NSŠPV.Mūsu pētījumā mēs noskaidrojām, ka pacientiem ar EGFR mutāciju (n = 41) vispārējie metabolisma profili bija līdzīgi pacientiem ar savvaļas tipa EGFR (n = 31), lai gan mēs konstatējām, ka dažiem EGFR mutācijas pacientiem ir pazemināts seruma līmenis acilkarnitīna pacientiem.Iedibinātā acilkarnitīnu funkcija ir transportēt acilgrupas no citoplazmas uz mitohondriju matricu, izraisot taukskābju oksidēšanos, lai iegūtu enerģiju55.Saskaņā ar mūsu atklājumiem nesen veiktā pētījumā tika noteikti līdzīgi metabolomu profili starp EGFR mutantu un EGFR savvaļas tipa audzējiem, analizējot 102 plaušu adenokarcinomas audu paraugu globālo metabolomu50.Interesanti, ka acilkarnitīna saturs tika konstatēts arī EGFR mutantu grupā.Tāpēc, vai acilkarnitīna līmeņa izmaiņas atspoguļo EGFR izraisītās vielmaiņas izmaiņas un pamatā esošos molekulāros ceļus, var būt nepieciešama turpmāka izpēte.
Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pētījums nosaka seruma metabolisma klasifikatoru plaušu mezgliņu diferenciāldiagnozei un ierosina darbplūsmu, kas var optimizēt riska novērtējumu un atvieglot klīnisko vadību, pamatojoties uz CT skenēšanas skrīningu.
Šo pētījumu apstiprināja Sun Yat-sen Universitātes vēža slimnīcas ētikas komiteja, Sun Yat-sen universitātes pirmā saistītā slimnīca un Džendžou Universitātes vēža slimnīcas ētikas komiteja.Atklāšanas un iekšējās validācijas grupās tika savākti 174 serumi no veseliem indivīdiem un 244 serumi no labdabīgiem mezgliņiem no personām, kurām tika veiktas ikgadējas medicīniskās pārbaudes Sun Yat-sen universitātes vēža centra Vēža kontroles un profilakses departamentā, un 166 labdabīgi mezgli.serums.I stadijas plaušu adenokarcinomas tika savāktas no Sun Yat-sen universitātes vēža centra.Ārējās validācijas grupā tika konstatēti 48 labdabīgu mezgliņu gadījumi, 39 I stadijas plaušu adenokarcinomas gadījumi no Sun Yat-sen universitātes pirmās saistītās slimnīcas un 24 I stadijas plaušu adenokarcinomas gadījumi no Džendžou vēža slimnīcas.Sun Yat-sen Universitātes vēža centrs arī savāca 16 I stadijas plakanšūnu plaušu vēža gadījumus, lai pārbaudītu izveidotā vielmaiņas klasifikatora diagnostisko spēju (pacienta īpašības ir parādītas 5. papildu tabulā).Paraugi no atklāšanas kohortas un iekšējās validācijas kohortas tika savākti no 2018. gada janvāra līdz 2020. gada maijam. Paraugi ārējai validācijas kohortai tika savākti no 2021. gada augusta līdz 2022. gada oktobrim. Lai samazinātu dzimumu aizspriedumus, katram tika piešķirts aptuveni vienāds vīriešu un sieviešu gadījumu skaits. kohorta.Atklāšanas komanda un iekšējās pārbaudes komanda.Dalībnieka dzimums tika noteikts, pamatojoties uz pašnovērtējumu.No visiem dalībniekiem tika iegūta informēta piekrišana, un kompensācija netika sniegta.Subjekti ar labdabīgiem mezgliņiem bija tie, kuriem analīzes laikā bija stabils CT skenēšanas rādītājs 2 līdz 5 gadu laikā, izņemot 1 gadījumu no ārējā validācijas parauga, kas tika savākts pirms operācijas un diagnosticēts ar histopatoloģiju.Izņemot hronisku bronhītu.Plaušu adenokarcinomas gadījumi tika savākti pirms plaušu rezekcijas un apstiprināti ar patoloģisku diagnozi.Asins paraugi tukšā dūšā tika savākti seruma atdalīšanas mēģenēs bez antikoagulantiem.Asins paraugus 1 stundu sarecēja istabas temperatūrā un pēc tam centrifugēja ar ātrumu 2851 × g 10 minūtes 4 ° C temperatūrā, lai savāktu seruma supernatantu.Seruma alikvotas tika sasaldētas -80 ° C temperatūrā līdz metabolīta ekstrakcijai.Sun Yat-sen Universitātes vēža centra Vēža profilakses un medicīniskās izmeklēšanas nodaļa savāca serumu no 100 veseliem donoriem, tostarp vienāda skaita vīriešu un sieviešu vecumā no 40 līdz 55 gadiem.Tika sajaukti vienādi katra donora parauga tilpumi, iegūtais kopums tika sadalīts alikvotās daļās un uzglabāts -80 ° C temperatūrā.Seruma maisījums tika izmantots kā atsauces materiāls kvalitātes kontrolei un datu standartizācijai.
Standarta serumu un testa paraugus atkausēja un metabolītus ekstrahēja, izmantojot kombinēto ekstrakcijas metodi (MTBE/metanols/ūdens)56.Īsumā, 50 μl seruma tika sajaukti ar 225 μl ledusauksta metanola un 750 μl ledusauksta metil-terc-butilētera (MTBE).Maisiet maisījumu un inkubējiet uz ledus 1 stundu.Pēc tam paraugus sajauca un virpuļoja ar 188 μl MS kvalitātes ūdens, kas satur iekšējos standartus (13C-laktāts, 13C3-piruvāts, 13C-metionīns un 13C6-izoleicīns, kas iegādāts no Cambridge Isotope Laboratories).Pēc tam maisījumu centrifugēja ar ātrumu 15 000 × g 10 minūtes 4 ° C temperatūrā, un apakšējā fāze tika pārnesta divās mēģenēs (katra 125 μL) LC-MS analīzei pozitīvā un negatīvā režīmā.Visbeidzot, paraugs tika iztvaicēts līdz sausam ātrgaitas vakuuma koncentratorā.
Žāvētie metabolīti tika izšķīdināti 120 μl 80% acetonitrila, maisīja 5 minūtes un centrifugēja ar ātrumu 15 000 × g 10 minūtes 4 ° C temperatūrā.Supernatanti tika pārvietoti dzintara stikla flakonos ar mikroieliktņiem metabolomikas pētījumiem.Nemērķtiecīga metabolomikas analīze uz īpaši efektīvas šķidruma hromatogrāfijas augstas izšķirtspējas masas spektrometrijas (UPLC-HRMS) platformas.Metabolīti tika atdalīti, izmantojot Dionex Ultimate 3000 UPLC sistēmu un ACQUITY BEH amīda kolonnu (2, 1 × 100 mm, 1, 7 μm, Waters).Pozitīvo jonu režīmā kustīgās fāzes bija 95% (A) un 50% acetonitrila (B), katra no tām satur 10 mmol/l amonija acetāta un 0,1% skudrskābes.Negatīvā režīmā mobilās fāzes A un B saturēja attiecīgi 95% un 50% acetonitrila, abas fāzes saturēja 10 mmol/L amonija acetātu, pH = 9. Gradienta programma bija šāda: 0–0,5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16.–16.1.min, 98 –2% B;16,1–20 min, 2% B. Kolonnas temperatūra tika uzturēta 40°C un paraugs 10°C automātiskajā paraugu ņemšanas ierīcē.Plūsmas ātrums bija 0,3 ml/min, injekcijas tilpums bija 3 μl.Q-Exactive Orbitrap masas spektrometrs (Thermo Fisher Scientific) ar elektrosmidzināšanas jonizācijas (ESI) avotu tika darbināts pilnas skenēšanas režīmā un savienots ar ddMS2 uzraudzības režīmu, lai savāktu lielu datu apjomu.MS parametri tika iestatīti šādi: izsmidzināšanas spriegums +3,8 kV/- 3,2 kV, kapilārā temperatūra 320°C, aizsarggāze 40 arb, palīggāze 10 arb, zondes sildītāja temperatūra 350°C, skenēšanas diapazons 70-1050 m/h, izšķirtspēju.70 000. Dati iegūti, izmantojot Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Lai novērtētu datu kvalitāti, tika izveidoti apvienoti kvalitātes kontroles (QC) paraugi, no katra parauga noņemot 10 μL supernatanta alikvotas.Analītiskās secības sākumā tika analizētas sešas kvalitātes kontroles paraugu injekcijas, lai novērtētu UPLC-MS sistēmas stabilitāti.Pēc tam kvalitātes kontroles paraugus periodiski ievada partijā.Visas 11 seruma paraugu partijas šajā pētījumā tika analizētas ar LC-MS.Seruma baseina maisījuma alikvotas no 100 veseliem donoriem tika izmantotas kā atsauces materiāls attiecīgajās partijās, lai uzraudzītu ekstrakcijas procesu un pielāgotu partiju iedarbībai.Sun Yat-sen Universitātes Metabolomikas centrā tika veikta atklāšanas, iekšējās validācijas kohortas un ārējās validācijas kohortas nemērķtiecīga metabolomikas analīze.Guandunas Tehnoloģiju universitātes analīzes un testēšanas centra ārējā laboratorija arī analizēja 40 paraugus no ārējās kohortas, lai pārbaudītu klasifikatora modeļa veiktspēju.
Pēc ekstrakcijas un atšķaidīšanas seruma metabolītu absolūtā kvantitatīvā noteikšana tika mērīta, izmantojot īpaši augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas-tandēma masas spektrometriju (Agilent 6495 trīskāršs kvadrupols) ar elektrosmidzināšanas jonizācijas (ESI) avotu vairāku reakciju uzraudzības (MRM) režīmā.Metabolītu atdalīšanai tika izmantota ACQUITY BEH amīda kolonna (2, 1 × 100 mm, 1, 7 μm, Voterss).Mobilā fāze sastāvēja no 90% (A) un 5% acetonitrila (B) ar 10 mmol/l amonija acetātu un 0,1% amonjaka šķīdumu.Gradienta programma bija šāda: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0%B.Automātiskajā paraugu ņemšanas ierīcē kolonnu uzturēja 40 ° C temperatūrā, bet paraugu 10 ° C temperatūrā.Plūsmas ātrums bija 0, 3 ml / min, un injekcijas tilpums bija 1 μL.MS parametri tika iestatīti šādi: kapilārais spriegums ±3,5 kV, smidzinātāja spiediens 35 psi, apvalka gāzes plūsma 12 L/min, apvalka gāzes temperatūra 350°C, žāvēšanas gāzes temperatūra 250°C un žāvēšanas gāzes plūsma 14 l/min.Triptofāna, piruvāta, laktāta, hipoksantīna un ksantīna MRM konversijas bija 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 un 151,0–107.9 attiecīgi.Dati tika savākti, izmantojot Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Seruma paraugiem triptofāns, piruvāts, laktāts, hipoksantīns un ksantīns tika kvantificēti, izmantojot standarta maisījuma šķīdumu kalibrēšanas līknes.Šūnu paraugiem triptofāna saturs tika normalizēts līdz iekšējam standartam un šūnu proteīna masai.
Pīķa ekstrakcija (m/z un aiztures laiks (RT)) tika veikta, izmantojot Compound Discovery 3.1 un TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Lai novērstu potenciālās atšķirības starp partijām, katra testa parauga raksturīgā virsotne tika sadalīta ar tās pašas partijas atsauces materiāla raksturīgo maksimumu, lai iegūtu relatīvo daudzumu.Iekšējo standartu relatīvās standartnovirzes pirms un pēc standartizācijas ir parādītas 6. papildu tabulā. Atšķirības starp abām grupām raksturoja ar viltus atklāšanas biežumu (FDR<0,05, Vilkoksona paraksta ranga tests) un izmaiņu reizēs (>1,2 vai <0,83).Neapstrādāti MS dati par iegūtajām iezīmēm un atsauces seruma koriģētie MS dati ir parādīti attiecīgi 1. papildu datos un 2. papildu datos.Maksimālā anotācija tika veikta, pamatojoties uz četriem noteiktiem identifikācijas līmeņiem, tostarp identificētiem metabolītiem, iespējami anotētiem savienojumiem, iespējamām raksturotām savienojumu klasēm un nezināmiem savienojumiem22.Pamatojoties uz datubāzes meklēšanu programmā Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), kā starpprodukti starp diferenciālo metabolomu beidzot tika izvēlēti bioloģiskie savienojumi ar apstiprinātiem standartiem vai precīzas atbilstības anotācijām mzCloud (rezultāts > 85) vai Chemspider.Maksimālās anotācijas katrai pazīmei ir iekļautas 3. papildu datos. MetaboAnalyst 5.0 tika izmantota summā normalizētā metabolītu daudzuma vienfaktoru analīzei.MetaboAnalyst 5.0 novērtēja arī KEGG ceļa bagātināšanas analīzi, pamatojoties uz ievērojami atšķirīgiem metabolītiem.Galveno komponentu analīze (PCA) un daļējā mazāko kvadrātu diskriminējošā analīze (PLS-DA) tika analizēta, izmantojot ropls programmatūras pakotni (v.1.26.4) ar steka normalizāciju un automātisko mērogošanu.Optimālais metabolīta biomarķiera modelis mezgla ļaundabīgo audzēju prognozēšanai tika ģenerēts, izmantojot bināro loģistisko regresiju ar vismazāko absolūto saraušanos un atlases operatoru (LASSO, R pakete v.4.1-3).Diskriminējošā modeļa veiktspēja noteikšanas un validācijas komplektos tika raksturota, novērtējot AUC, pamatojoties uz ROC analīzi saskaņā ar pROC pakotni (v.1.18.0.).Optimālā varbūtības robežvērtība tika iegūta, pamatojoties uz modeļa maksimālo Youden indeksu (jutība + specifiskums – 1).Paraugi, kuru vērtības ir mazākas vai lielākas par slieksni, tiks prognozēti attiecīgi kā labdabīgi mezgliņi un plaušu adenokarcinoma.
A549 šūnas (#CCL-185, American Type Culture Collection) tika audzētas F-12K barotnē, kas satur 10% FBS.Lentivīrusa vektorā pLKO.1-puro tika ievietotas īsas matadata RNS (shRNS) sekvences, kuru mērķis bija SLC7A5, un nemērķtiecīga kontrole (NC).ShSLC7A5 antisensu sekvences ir šādas: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Antivielas pret SLC7A5 (#5347) un tubulīnu (#2148) tika iegādātas no Cell Signaling Technology.Western blot analīzei antivielas pret SLC7A5 un tubulīnu tika izmantotas atšķaidījumā 1:1000.
Seahorse XF glikolītiskā stresa tests nosaka ekstracelulārās paskābināšanās (ECAR) līmeni.Pārbaudē secīgi tika ievadīta glikoze, oligomicīns A un 2-DG, lai pārbaudītu šūnu glikolītisko spēju, ko mēra ar ECAR.
A549 šūnas, kas transficētas ar nemērķtiecīgu kontroli (NC) un shSLC7A5 (Sh1, Sh2), tika uzklātas uz nakti 10 cm diametra trauciņos.Šūnu metabolīti tika ekstrahēti ar 1 ml ledusauksta 80% metanola ūdens.Metanola šķīdumā esošās šūnas tika nokasītas, savāktas jaunā mēģenē un centrifugētas ar ātrumu 15 000 × g 15 minūtes 4 ° C temperatūrā.Savāc 800 µl supernatanta un nosusina, izmantojot ātrdarbīgu vakuuma koncentratoru.Pēc tam žāvētās metabolīta granulas tika analizētas attiecībā uz triptofāna līmeni, izmantojot LC-MS/MS, kā aprakstīts iepriekš.Šūnu NAD(H) līmeņi A549 šūnās (NC un shSLC7A5) tika mērīti, izmantojot kvantitatīvu NAD+/NADH kolorimetrisko komplektu (#K337, BioVision) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.Katram paraugam tika mērīts olbaltumvielu līmenis, lai normalizētu metabolītu daudzumu.
Lai provizoriski noteiktu izlases lielumu, netika izmantotas statistikas metodes.Iepriekšējie metabolomikas pētījumi, kuru mērķis bija atklāt biomarķieru 15, 18, tika uzskatīti par etaloniem lieluma noteikšanai, un, salīdzinot ar šiem ziņojumiem, mūsu paraugs bija atbilstošs.Neviens paraugs netika izslēgts no pētījuma kohortas.Seruma paraugi tika nejauši iedalīti atklāšanas grupā (306 gadījumi, 74,6%) un iekšējā validācijas grupā (104 gadījumi, 25,4%) nemērķtiecīgiem metabolomikas pētījumiem.Mēs arī nejauši izvēlējāmies 70 gadījumus no katras grupas no atklājumu kopas mērķtiecīgiem metabolomikas pētījumiem.LC-MS datu vākšanas un analīzes laikā pētnieki bija akli pret grupu piešķiršanu.Metabolomikas datu statistiskā analīze un šūnu eksperimenti ir aprakstīti attiecīgajās sadaļās Rezultāti, Attēlu leģendas un Metodes.Šūnu triptofāna, NADT un glikolītiskās aktivitātes kvantitatīvā noteikšana tika veikta trīs reizes neatkarīgi ar identiskiem rezultātiem.
Lai iegūtu papildinformāciju par pētījuma plānu, skatiet ar šo rakstu saistīto Dabiskā portfeļa pārskata kopsavilkumu.
Ekstrahēto pazīmju neapstrādātie MS dati un standartseruma normalizētie MS dati ir parādīti attiecīgi 1. papildu datos un 2. papildu datos.Maksimālās anotācijas diferenciālām pazīmēm ir parādītas 3. papildu datos. LUAD TCGA datu kopu var lejupielādēt no https://portal.gdc.cancer.gov/.Ievaddati grafika uzzīmēšanai ir sniegti avota datos.Šim rakstam ir sniegti avota dati.
Valsts plaušu skrīninga pētījumu grupa utt. Mirstības no plaušu vēža samazināšana ar mazas devas datortomogrāfiju.Ziemeļanglija.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR un Prophet, PC Plaušu vēža skrīnings, izmantojot mazas devas spirālveida CT: Nacionālā plaušu skrīninga pētījuma (NLST) rezultāti.J. Med.18. ekrāns, 109–111 (2011).
De Konings, HJ u.c.Plaušu vēža mirstības samazināšana ar tilpuma CT skrīningu randomizētā pētījumā.Ziemeļanglija.J. Med.382, 503–513 (2020).
Izlikšanas laiks: 18. septembris 2023. gada laikā