Ar datortomogrāfiju (DT) identificētu plaušu mezgliņu diferenciāldiagnoze joprojām ir izaicinājums klīniskajā praksē. Šeit mēs raksturojam 480 seruma paraugu globālo metabolomu, tostarp veselīgu kontroles personu, labdabīgu plaušu mezgliņu un I stadijas plaušu adenokarcinomas. Adenokarcinomām ir unikāli metabolomiskie profili, savukārt labdabīgiem mezgliņiem un veseliem indivīdiem ir augsta metabolomisko profilu līdzība. Atklāšanas grupā (n = 306) tika identificēts 27 metabolītu kopums, lai diferencētu labdabīgus un ļaundabīgus mezgliņus. Diferencējošā modeļa AUC iekšējās validācijas (n = 104) un ārējās validācijas (n = 111) grupās bija attiecīgi 0,915 un 0,945. Ceļa analīze atklāja palielinātu glikolītisko metabolītu daudzumu, kas saistīts ar samazinātu triptofāna daudzumu plaušu adenokarcinomas serumā, salīdzinot ar labdabīgiem mezgliņiem un veseliem kontroles dalībniekiem, un liecināja, ka triptofāna uzņemšana veicina glikolīzi plaušu vēža šūnās. Mūsu pētījums izceļ seruma metabolītu biomarķieru vērtību DT atklāto plaušu mezgliņu riska novērtēšanā.
Agrīna diagnostika ir kritiski svarīga, lai uzlabotu vēža pacientu izdzīvošanas rādītājus. ASV Nacionālā plaušu vēža skrīninga pētījuma (NLST) un Eiropas NELSON pētījuma rezultāti liecina, ka skrīnings ar zemas devas datortomogrāfiju (LDCT) var ievērojami samazināt plaušu vēža mirstību augsta riska grupās1,2,3. Kopš LDCT plašas izmantošanas plaušu vēža skrīningam, asimptomātisku plaušu mezgliņu nejaušas radiogrāfiskas atradnes biežums ir turpinājis pieaugt4. Plaušu mezgliņi ir definēti kā fokāli necaurredzamības līdz 3 cm diametrā5. Mēs saskaramies ar grūtībām novērtēt ļaundabīgo audzēju iespējamību un tikt galā ar lielo skaitu plaušu mezgliņu, kas nejauši atklāti LDCT. DT ierobežojumi var izraisīt biežas atkārtotas pārbaudes un viltus pozitīvus rezultātus, kas noved pie nevajadzīgas iejaukšanās un pārmērīgas ārstēšanas6. Tāpēc ir nepieciešams izstrādāt uzticamus un noderīgus biomarķierus, lai pareizi identificētu plaušu vēzi agrīnās stadijās un diferencētu lielāko daļu labdabīgo mezgliņu sākotnējās atklāšanas laikā7.
Visaptveroša asins (seruma, plazmas, perifēro asiņu mononukleāro šūnu) molekulārā analīze, tostarp genomika, proteomika vai DNS metilēšana8,9,10, ir izraisījusi pieaugošu interesi par plaušu vēža diagnostisko biomarķieru atklāšanu. Tikmēr metabolomikas pieejas mēra šūnu gala produktus, kurus ietekmē endogēnas un eksogēnas darbības, un tāpēc tās tiek izmantotas, lai prognozētu slimības sākšanos un iznākumu. Šķidruma hromatogrāfijas-tandēma masas spektrometrija (LC-MS) ir plaši izmantota metode metabolomikas pētījumos, pateicoties tās augstajai jutībai un plašajam dinamiskajam diapazonam, kas var aptvert metabolītus ar dažādām fizikāli ķīmiskām īpašībām11,12,13. Lai gan globālā plazmas/seruma metabolomikas analīze ir izmantota, lai identificētu biomarķierus, kas saistīti ar plaušu vēža diagnozi14,15,16,17 un ārstēšanas efektivitāti,18 seruma metabolītu klasifikatori, lai atšķirtu labdabīgus un ļaundabīgus plaušu mezgliņus, joprojām ir daudz pētīti. - masveida pētījumi.
Adenokarcinoma un plakanšūnu karcinoma ir divi galvenie nesīkšūnu plaušu vēža (NSCLC) apakštipi. Dažādi DT skrīninga testi liecina, ka adenokarcinoma ir visizplatītākais plaušu vēža histoloģiskais veids1,19,20,21. Šajā pētījumā mēs izmantojām īpaši efektīvas šķidruma hromatogrāfijas-augstas izšķirtspējas masas spektrometrijas (UPLC-HRMS) metodi, lai veiktu metabolomikas analīzi kopumā 695 seruma paraugiem, tostarp veseliem kontroles subjektiem, labdabīgiem plaušu mezgliņiem un ar DT atklātiem ≤3 cm. I stadijas plaušu adenokarcinomas skrīnings. Mēs identificējām seruma metabolītu paneli, kas atšķir plaušu adenokarcinomu no labdabīgiem mezgliņiem un veseliem kontroles subjektiem. Ceļa bagātināšanas analīze atklāja, ka patoloģiska triptofāna un glikozes metabolisms ir bieži sastopamas izmaiņas plaušu adenokarcinomā, salīdzinot ar labdabīgiem mezgliņiem un veseliem kontroles subjektiem. Visbeidzot, mēs izveidojām un validējām seruma metabolisma klasifikatoru ar augstu specifiskumu un jutību, lai atšķirtu ļaundabīgus un labdabīgus plaušu mezgliņus, kas atklāti ar LDCT, kas var palīdzēt agrīnā diferenciāldiagnozē un riska novērtēšanā.
Pašreizējā pētījumā no 174 veseliem kontroles dalībniekiem, 292 pacientiem ar labdabīgiem plaušu mezgliņiem un 229 pacientiem ar I stadijas plaušu adenokarcinomu tika retrospektīvi savākti pēc dzimuma un vecuma saskaņoti seruma paraugi. 695 subjektu demogrāfiskie raksturlielumi ir parādīti 1. papildtabulā.
Kā parādīts 1.a attēlā, Sun Yat-sen Universitātes Vēža centrā tika savākti kopumā 480 seruma paraugi, tostarp 174 veselu kontroles personu (HC), 170 labdabīgu mezgliņu (BN) un 136 I stadijas plaušu adenokarcinomas (LA) paraugi. Atklāšanas kohorta nemērķtiecīgai metabolomikas profilēšanai, izmantojot īpaši jaudīgas šķidruma hromatogrāfijas-augstas izšķirtspējas masas spektrometrijas (UPLC-HRMS) metodi. Kā parādīts 1. papildattēlā, lai izveidotu klasifikācijas modeli un tālāk izpētītu diferenciālo ceļu analīzi, tika identificēti diferenciālie metabolīti starp LA un HC, LA un BN. 104 paraugi, ko savāca Sun Yat-sen Universitātes Vēža centrs, un 111 paraugi, ko savāca divas citas slimnīcas, tika attiecīgi pakļauti iekšējai un ārējai validācijai.
a Pētījuma populācija atklāšanas kohortā, kurai tika veikta globāla seruma metabolomikas analīze, izmantojot īpaši efektīvas šķidruma hromatogrāfijas-augstas izšķirtspējas masas spektrometriju (UPLC-HRMS). b Pētījuma kohortas 480 seruma paraugu kopējā metaboloma daļēja mazāko kvadrātu diskriminantanalīze (PLS-DA), ieskaitot veselus kontroles dalībniekus (HC, n = 174), labdabīgus mezgliņus (BN, n = 170) un I stadijas plaušu adenokarcinomu (Losandželosa, n = 136). +ESI, pozitīvs elektroizsmidzināšanas jonizācijas režīms, -ESI, negatīvs elektroizsmidzināšanas jonizācijas režīms. c–e Metabolīti ar ievērojami atšķirīgu daudzumu divās dotajās grupās (divpusējs Vilkoksona zīmju rangu tests, pēc kļūdainas atklāšanas ātruma koriģēta p vērtība, FDR <0,05) ir parādīti sarkanā krāsā (reizes izmaiņas > 1,2) un zilā krāsā (reizes izmaiņas < 0,83). ), kas parādīti vulkāna grafikā. f Hierarhiska klasterizācijas siltuma karte, kas parāda būtiskas atšķirības anotēto metabolītu skaitā starp LA un BN. Avota dati tiek sniegti avota datu failu veidā.
Atklāšanas grupā kopējais seruma metabolīts 174 HC, 170 BN un 136 LA tika analizēts, izmantojot UPLC-HRMS analīzi. Vispirms mēs parādām, ka kvalitātes kontroles (KK) paraugi cieši grupējas neuzraudzītas galveno komponentu analīzes (PCA) modeļa centrā, apstiprinot pašreizējā pētījuma veiktspējas stabilitāti (2. papildattēls).
Kā parādīts 1.b attēlā redzamajā daļējās mazāko kvadrātu diskriminantanalīzē (PLS-DA), mēs atklājām skaidras atšķirības starp LA un BN, LA un HC pozitīvā (+ESI) un negatīvā (-ESI) elektrospray jonizācijas režīmos. Tomēr netika konstatētas būtiskas atšķirības starp BN un HC +ESI un -ESI apstākļos.
Mēs atradām 382 diferenciālās pazīmes starp LA un HC, 231 diferenciālo pazīmi starp LA un BN un 95 diferenciālās pazīmes starp BN un HC (Vilkoksona zīmju rangu tests, FDR <0,05 un daudzkārtēja izmaiņa >1,2 vai <0,83) (1.c–e attēls). . Pīķi tika tālāk anotēti (3. papilddati) pret datubāzi (mzCloud/HMDB/Chemspider bibliotēka), izmantojot m/z vērtību, aiztures laiku un fragmentācijas masas spektra meklēšanu (sīkāka informācija aprakstīta sadaļā Metodes)22. Visbeidzot, LA pret BN (1.f attēls un 2. papildtabula) un LA pret HC (3. papildattēls un 2. papildtabula) tika identificēti attiecīgi 33 un 38 anotēti metabolīti ar būtiskām atšķirībām pārpilnībā. Turpretī BN un HC tika identificēti tikai 3 metabolīti ar būtiskām atšķirībām pārpilnībā (2. papildtabula), kas atbilst BN un HC pārklāšanai PLS-DA. Šie diferenciālie metabolīti aptver plašu bioķīmisko vielu klāstu (4. papildattēls). Kopumā šie rezultāti liecina par būtiskām izmaiņām seruma metabolomā, kas atspoguļo agrīnas stadijas plaušu vēža ļaundabīgu transformāciju, salīdzinot ar labdabīgiem plaušu mezgliņiem vai veseliem cilvēkiem. Tikmēr BN un HC seruma metaboloma līdzība liecina, ka labdabīgiem plaušu mezgliņiem var būt daudzas kopīgas bioloģiskās īpašības ar veseliem cilvēkiem. Ņemot vērā, ka epidermas augšanas faktora receptora (EGFR) gēna mutācijas ir bieži sastopamas plaušu adenokarcinomas 23. apakštipa gadījumā, mēs centāmies noteikt virzītājspēka mutāciju ietekmi uz seruma metabolomu. Pēc tam mēs analizējām 72 gadījumu ar EGFR statusu kopējo metabolomisko profilu plaušu adenokarcinomas grupā. Interesanti, ka PCA analīzē mēs atradām salīdzināmus profilus starp pacientiem ar EGFR mutantu (n = 41) un pacientiem ar EGFR savvaļas tipu (n = 31) (5.a papildattēls). Tomēr mēs identificējām 7 metabolītus, kuru daudzums bija ievērojami mainījies pacientiem ar EGFR mutāciju, salīdzinot ar pacientiem ar savvaļas tipa EGFR (t tests, p < 0,05 un reizes izmaiņas > 1,2 vai < 0,83) (5.b papildattēls). Lielākā daļa šo metabolītu (5 no 7) ir acilkarnitīni, kuriem ir svarīga loma taukskābju oksidācijas ceļos.
Kā parādīts 2.a attēlā redzamajā darbplūsmā, mezgliņu klasifikācijas biomarķieri tika iegūti, izmantojot mazākās absolūtās saraušanās operatorus un atlasi, pamatojoties uz 33 diferenciālajiem metabolītiem, kas identificēti LA (n = 136) un BN (n = 170). Mainīgo labākā kombinācija (LASSO) – binārais loģistiskās regresijas modelis. Modeļa ticamības pārbaudei tika izmantota desmitkārtīga krustvalidācija. Mainīgo atlase un parametru regularizācija tiek koriģēta ar ticamības maksimizācijas sodu ar parametru λ24. Globālā metabolomikas analīze tika veikta neatkarīgi iekšējās validācijas (n = 104) un ārējās validācijas (n = 111) grupās, lai pārbaudītu diskriminanta modeļa klasifikācijas veiktspēju. Rezultātā 27 metabolīti atklāšanas kopā tika identificēti kā labākais diskriminanta modelis ar lielāko vidējo AUC vērtību (2.b att.), starp kuriem 9 bija palielināta aktivitāte un 18 samazināta aktivitāte LA salīdzinājumā ar BN (2.c att.).
Darbplūsma plaušu mezgliņu klasifikatora izveidei, tostarp labākā seruma metabolītu paneļa atlase atklāšanas kopā, izmantojot bināro loģistiskās regresijas modeli ar desmitkārtīgu krustvalidāciju, un prognozēšanas veiktspējas novērtēšana iekšējās un ārējās validācijas kopās. b LASSO regresijas modeļa krustvalidācijas statistika vielmaiņas biomarķieru izvēlei. Iepriekš norādītie skaitļi apzīmē vidējo biomarķieru skaitu, kas atlasīti pie dotā λ. Sarkanā punktētā līnija apzīmē vidējo AUC vērtību pie atbilstošās lambda. Pelēkās kļūdu joslas apzīmē minimālās un maksimālās AUC vērtības. Punktētā līnija norāda labāko modeli ar 27 atlasītajiem biomarķieriem. AUC, laukums zem uztvērēja darbības raksturlīknes (ROC) līknes. c 27 atlasīto metabolītu izmaiņas LA grupā salīdzinājumā ar BN grupu atklāšanas grupā. Sarkanā kolonna – aktivācija. Zilā kolonna ir samazinājums. d–f Uztvērēja darbības raksturlīknes (ROC) līknes, kas parāda diskriminanta modeļa jaudu, pamatojoties uz 27 metabolītu kombinācijām atklāšanas, iekšējās un ārējās validācijas kopās. Avota dati ir sniegti avota datu failu veidā.
Prognozēšanas modelis tika izveidots, pamatojoties uz šo 27 metabolītu svērtajiem regresijas koeficientiem (3. papildtabula). ROC analīze, kuras pamatā bija šie 27 metabolīti, deva laukumu zem līknes (AUC) 0,933, atklāšanas grupas jutība bija 0,868 un specifiskums bija 0,859 (2. d att.). Tikmēr starp 38 anotētajiem diferenciālajiem metabolītiem starp LA un HC, 16 metabolītu kopa sasniedza AUC 0,902 ar jutību 0,801 un specifiskumu 0,856, atšķirot LA no HC (6. papildattēls a–c). Tika salīdzinātas arī AUC vērtības, kas balstītas uz dažādiem diferenciālo metabolītu reizes izmaiņu sliekšņiem. Mēs atklājām, ka klasifikācijas modelis vislabāk darbojās, atšķirot LA un BN (HC), kad reizes izmaiņu līmenis tika iestatīts uz 1,2 pret 1,5 vai 2,0 (7. papildattēls a, b). Klasifikācijas modelis, kas balstīts uz 27 metabolītu grupām, tika tālāk validēts iekšējās un ārējās kohortās. Iekšējai validācijai AUC bija 0,915 (jutība 0,867, specifiskums 0,811) un ārējai validācijai 0,945 (jutība 0,810, specifiskums 0,979) (2.e, f att.). Lai novērtētu starplaboratoriju efektivitāti, 40 paraugi no ārējās kohortas tika analizēti ārējā laboratorijā, kā aprakstīts sadaļā Metodes. Klasifikācijas precizitāte sasniedza AUC 0,925 (8. papildattēls). Tā kā plaušu plakanšūnu karcinoma (LUSC) ir otrais izplatītākais nesīkšūnu plaušu vēža (NSCLC) apakštips pēc plaušu adenokarcinomas (LUAD), mēs pārbaudījām arī validēto vielmaiņas profilu potenciālo lietderību. BN un 16 LUSC gadījumi. LUSC un BN atšķiršanas AUC bija 0,776 (9. papildattēls), kas norāda uz sliktākām spējām salīdzinājumā ar LUAD un BN atšķiršanu.
Pētījumi liecina, ka mezgliņu izmērs datortomogrāfijas attēlos ir pozitīvi korelēts ar ļaundabīgu audzēju iespējamību un joprojām ir galvenais mezgliņu ārstēšanas noteicošais faktors25,26,27. NELSON skrīninga pētījuma lielās kohortas datu analīze parādīja, ka ļaundabīgu audzēju risks subjektiem ar limfmezgliem <5 mm bija pat līdzīgs subjektiem bez limfmezgliem28. Tāpēc minimālais izmērs, kam nepieciešama regulāra datortomogrāfijas uzraudzība, ir 5 mm, kā iesaka Britu Torakālās biedrības (BTS), un 6 mm, kā iesaka Fleišnera biedrības29. Tomēr mezgliņi, kas lielāki par 6 mm un bez acīmredzamām labdabīgām pazīmēm, ko sauc par nenoteiktiem plaušu mezgliņiem (IPN), joprojām ir galvenais izaicinājums novērtēšanai un ārstēšanai klīniskajā praksē30,31. Pēc tam mēs pārbaudījām, vai mezgliņu izmērs ietekmē metabolomiskos parakstus, izmantojot apkopotus paraugus no atklāšanas un iekšējās validācijas kohortām. Koncentrējoties uz 27 validētiem biomarķieriem, mēs vispirms salīdzinājām HC un BN metabolomu zem 6 mm PCA profilus. Mēs atklājām, ka lielākā daļa HC un BN datu punktu pārklājās, kas pierāda, ka seruma metabolītu līmenis abās grupās bija līdzīgs (3.a att.). BN un LA pazīmju kartes dažādos izmēru diapazonos saglabājās (3.b, c att.), savukārt atšķirība starp ļaundabīgiem un labdabīgiem mezgliņiem tika novērota 6–20 mm diapazonā (3.d att.). Šīs kohortas AUC bija 0,927, specifiskums 0,868 un jutība 0,820 6 līdz 20 mm mezgliņu ļaundabīguma prognozēšanai (3.e, f att.). Mūsu rezultāti liecina, ka klasifikators var uztvert vielmaiņas izmaiņas, ko izraisa agrīna ļaundabīga transformācija, neatkarīgi no mezgliņa lieluma.
ad PCA profilu salīdzinājums starp noteiktām grupām, pamatojoties uz 27 metabolītu metabolisma klasifikatoru. CC un BN < 6 mm. b BN < 6 mm pret BN 6–20 mm. LA 6–20 mm pret LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm un LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Uztvērēja darbības raksturlīknes (ROC) līkne, kas parāda diskriminanta modeļa veiktspēju mezgliņiem 6–20 mm. f Varbūtības vērtības tika aprēķinātas, pamatojoties uz loģistiskās regresijas modeli mezgliņiem 6–20 mm izmērā. Pelēkā punktētā līnija apzīmē optimālo robežvērtību (0,455). Iepriekš minētie skaitļi apzīmē Losandželosai prognozēto gadījumu procentuālo daļu. Izmantojiet divpusēju Stjudenta t testu. PCA, galveno komponentu analīze. AUC laukums zem līknes. Avota dati ir sniegti avota datu failu veidā.
Lai ilustrētu ierosinātā ļaundabīgo audzēju prognozēšanas modeļa veiktspēju, tika atlasīti četri paraugi (vecumā no 44 līdz 61 gadam) ar līdzīgiem plaušu mezgliņu izmēriem (7–9 mm) (4.a, b att.). Sākotnējā skrīningā 1. gadījums bija ciets mezgliņš ar kalcifikāciju, kas ir pazīme, kas saistīta ar labdabīgumu, savukārt 2. gadījums bija nenoteikts daļēji ciets mezgliņš bez acīmredzamām labdabīgām pazīmēm. Trīs turpmākās datortomogrāfijas skenēšanas kārtas parādīja, ka šie gadījumi 4 gadu laikā saglabājās stabili un tāpēc tika uzskatīti par labdabīgiem mezgliņiem (4.a att.). Salīdzinot ar sērijveida datortomogrāfijas skenējumu klīnisko novērtējumu, vienreizēja seruma metabolītu analīze ar pašreizējo klasifikatora modeli ātri un pareizi identificēja šos labdabīgos mezgliņus, pamatojoties uz varbūtības ierobežojumiem (1. tabula). 4.b attēlā 3. gadījumā parādīts mezgliņš ar pleiras retrakcijas pazīmēm, kas visbiežāk ir saistīta ar ļaundabīgu audzēju32. 4. gadījums bija nenoteikts daļēji ciets mezgliņš bez labdabīga cēloņa pazīmēm. Visi šie gadījumi saskaņā ar klasifikatora modeli tika prognozēti kā ļaundabīgi (1. tabula). Plaušu adenokarcinomas novērtējums tika pierādīts ar histopatoloģisku izmeklēšanu pēc plaušu rezekcijas operācijas (4.b att.). Ārējai validācijas kopai vielmaiņas klasifikators precīzi paredzēja divus nenoteiktu plaušu mezgliņu gadījumus, kas lielāki par 6 mm (10. papildattēls).
Divu labdabīgu mezgliņu gadījumu plaušu aksiālā loga datortomogrāfijas attēli. 1. gadījumā datortomogrāfija pēc 4 gadiem atklāja stabilu, cietu mezgliņu 7 mm diametrā ar kalcifikāciju labajā apakšējā daivā. 2. gadījumā datortomogrāfija pēc 5 gadiem atklāja stabilu, daļēji cietu mezgliņu 7 mm diametrā labajā augšējā daivā. b Aksiālā loga datortomogrāfijas attēli plaušām un atbilstošie patoloģiskie pētījumi diviem I stadijas adenokarcinomas gadījumiem pirms plaušu rezekcijas. 3. gadījumā tika atklāts mezgliņš 8 mm diametrā labajā augšējā daivā ar pleiras retrakciju. 4. gadījumā kreisajā augšējā daivā tika atklāts daļēji ciets matēta stikla mezgliņš 9 mm diametrā. Rezektēto plaušu audu hematoksilīna un eozīna (H&E) krāsošana (mēroga josla = 50 μm) parāda plaušu adenokarcinomas acināro augšanas modeli. Bultiņas norāda datortomogrāfijas attēlos atklātos mezgliņus. H&E attēli ir reprezentatīvi attēli ar vairākiem (>3) mikroskopiskiem laukiem, ko pārbaudījis patologs.
Kopumā mūsu rezultāti parāda seruma metabolītu biomarķieru potenciālo vērtību plaušu mezgliņu diferenciāldiagnozē, kas var radīt problēmas, izvērtējot DT skrīningu.
Pamatojoties uz validētu diferenciālo metabolītu paneli, mēs centāmies identificēt galveno metabolisma izmaiņu bioloģiskās korelācijas. MetaboAnalyst veiktā KEGG ceļa bagātināšanas analīze identificēja 6 kopīgus būtiski mainītus ceļus starp abām dotajām grupām (LA pret HC un LA pret BN, koriģēts p ≤ 0,001, efekts > 0,01). Šīs izmaiņas raksturoja piruvāta metabolisma, triptofāna metabolisma, niacīna un nikotīnamīda metabolisma, glikolīzes, TCA cikla un purīna metabolisma traucējumi (5.a att.). Pēc tam mēs veicām mērķtiecīgu metabolomiku, lai pārbaudītu galvenās izmaiņas, izmantojot absolūto kvantitatīvo noteikšanu. Bieži mainīto ceļu bieži sastopamo metabolītu noteikšana ar trīskāršo kvadrupola masas spektrometriju (QQQ), izmantojot autentiskus metabolītu standartus. Metabolomikas pētījuma mērķa parauga demogrāfiskie raksturlielumi ir iekļauti 4. papildtabulā. Saskaņā ar mūsu globālajiem metabolomikas rezultātiem kvantitatīvā analīze apstiprināja, ka hipoksantīna un ksantīna, piruvāta un laktāta līmenis LA bija paaugstināts salīdzinājumā ar BN un HC (5.b, c att., p <0,05). Tomēr starp BN un HC netika konstatētas būtiskas atšķirības šajos metabolītos.
KEGG ceļa bagātināšanas analīze, kurā LA grupā tika konstatēti būtiski atšķirīgi metabolīti, salīdzinot ar BN un HC grupām. Tika izmantots divpusējs Globaltest, un p vērtības tika koriģētas, izmantojot Holma-Bonferroni metodi (koriģēts p ≤ 0,001 un efekta lielums > 0,01). b–d Violin diagrammas, kas parāda hipoksantīna, ksantīna, laktāta, piruvāta un triptofāna līmeni seruma HC, BN un LA, kas noteikts ar LC-MS/MS (n = 70 katrā grupā). Baltās un melnās punktētās līnijas norāda attiecīgi mediānu un kvartili. e Violin diagramma, kas parāda normalizētu Log2TPM (transkriptu uz miljonu) SLC7A5 un QPRT mRNS ekspresiju plaušu adenokarcinomā (n = 513), salīdzinot ar normāliem plaušu audiem (n = 59) LUAD-TCGA datu kopā. Baltais lodziņš apzīmē starpkvartiļu diapazonu, horizontālā melnā līnija centrā apzīmē mediānu, un vertikālā melnā līnija, kas stiepjas no lodziņa, apzīmē 95% ticamības intervālu (TI). f Pīrsona korelācijas diagramma SLC7A5 un GAPDH ekspresijai plaušu adenokarcinomā (n = 513) un normālos plaušu audos (n = 59) TCGA datu kopā. Pelēkā zona apzīmē 95% TI. r, Pīrsona korelācijas koeficients. g Normalizēti šūnu triptofāna līmeņi A549 šūnās, kas transfektētas ar nespecifisku shRNS kontroli (NC) un shSLC7A5 (Sh1, Sh2), noteikti ar LC-MS/MS. Tiek sniegta piecu bioloģiski neatkarīgu paraugu statistiskā analīze katrā grupā. h NADt (kopējā NAD, ieskaitot NAD+ un NADH) šūnu līmeņi A549 šūnās (NC) un SLC7A5 ekspresijas nomākšanas A549 šūnās (Sh1, Sh2). Tiek sniegta trīs bioloģiski neatkarīgu paraugu statistiskā analīze katrā grupā. i A549 šūnu glikolītiskā aktivitāte pirms un pēc SLC7A5 ekspresijas nomākšanas tika mērīta ar ekstracelulāro paskābināšanas ātrumu (ECAR) (n = 4 bioloģiski neatkarīgi paraugi katrā grupā). 2-DG,2-deoksi-D-glikoze. (b–h) tika izmantots divpusējs Stjudenta t-tests. (g–i) punktos kļūdu joslas apzīmē vidējo vērtību ± standartnovirzi, katrs eksperiments tika veikts trīs reizes neatkarīgi, un rezultāti bija līdzīgi. Avota dati ir sniegti avota datu failu veidā.
Ņemot vērā triptofāna metabolisma izmaiņu būtisko ietekmi LA grupā, mēs, izmantojot QQQ, novērtējām arī seruma triptofāna līmeni HC, BN un LA grupās. Mēs atklājām, ka seruma triptofāna līmenis LA grupā bija samazināts salīdzinājumā ar HC vai BN (p < 0,001, 5.d attēls), kas atbilst iepriekšējiem atklājumiem, ka cirkulējošais triptofāna līmenis pacientiem ar plaušu vēzi ir zemāks nekā veseliem kontroles grupas dalībniekiem33,34,35. Citā pētījumā, kurā tika izmantots PET/CT marķieris 11C-metil-L-triptofāns, tika atklāts, ka triptofāna signāla aiztures laiks plaušu vēža audos bija ievērojami palielināts, salīdzinot ar labdabīgiem bojājumiem vai normāliem audiem36. Mēs izvirzām hipotēzi, ka triptofāna samazināšanās LA serumā var atspoguļot aktīvu triptofāna uzņemšanu plaušu vēža šūnās.
Ir arī zināms, ka triptofāna katabolisma kinurenīna ceļa gala produkts ir NAD+37,38, kas ir svarīgs substrāts gliceraldehīda-3-fosfāta reakcijai ar 1,3-bisfosfoglicerātu glikolīzes procesā39. Lai gan iepriekšējie pētījumi bija vērsti uz triptofāna katabolisma lomu imūnsistēmas regulācijā, mēs centāmies noskaidrot mijiedarbību starp triptofāna disregulāciju un glikolīzes ceļiem, kas novērota pašreizējā pētījumā. Ir zināms, ka šķīdinātāju transportētāju saimes 7. loceklis 5 (SLC7A5) ir triptofāna transportētājs43,44,45. Hinolīnskābes fosforiboziltransferāze (QPRT) ir enzīms, kas atrodas lejpus kinurenīna ceļa un pārvērš hinolīnskābi par NAMN46. LUAD TCGA datu kopas pārbaude atklāja, ka gan SLC7A5, gan QPRT bija ievērojami paaugstināti audzēja audos, salīdzinot ar normāliem audiem (5.e att.). Šis pieaugums tika novērots plaušu adenokarcinomas I un II stadijā, kā arī III un IV stadijā (11. papildattēls), kas norāda uz agrīniem triptofāna metabolisma traucējumiem, kas saistīti ar audzēja veidošanos.
Turklāt LUAD-TCGA datu kopa uzrādīja pozitīvu korelāciju starp SLC7A5 un GAPDH mRNS ekspresiju vēža pacientu paraugos (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5.f attēls). Turpretī normālos plaušu audos netika konstatēta būtiska korelācija starp šādiem gēnu parakstiem (r = 0,25, p = 0,06, 5.f attēls). SLC7A5 ekspresijas nomākšana (12. papildattēls) A549 šūnās ievērojami samazināja šūnu triptofāna un NAD(H) līmeni (5.g,h attēls), kā rezultātā samazinājās glikolītiskā aktivitāte, ko mēra ar ekstracelulāro paskābināšanās ātrumu (ECAR) (1.i attēls). Tādējādi, pamatojoties uz vielmaiņas izmaiņām serumā un in vitro noteikšanu, mēs izvirzām hipotēzi, ka triptofāna metabolisms var radīt NAD+ caur kinurenīna ceļu un spēlēt svarīgu lomu glikolīzes veicināšanā plaušu vēža gadījumā.
Pētījumi liecina, ka liels skaits nenoteiktu plaušu mezgliņu, kas atklāti ar LDCT, var radīt nepieciešamību pēc papildu testēšanas, piemēram, PET-CT, plaušu biopsijas un pārmērīgas ārstēšanas viltus pozitīvas ļaundabīgā audzēja diagnozes dēļ.31 Kā parādīts 6. attēlā, mūsu pētījumā tika identificēts seruma metabolītu panelis ar potenciālu diagnostisku vērtību, kas varētu uzlabot riska stratifikāciju un sekojošu DT atklāto plaušu mezgliņu ārstēšanu.
Plaušu mezgliņus novērtē, izmantojot zemas devas datortomogrāfiju (LDCT), un attēlveidošanas pazīmes liecina par labdabīgiem vai ļaundabīgiem cēloņiem. Neskaidrs mezgliņu iznākums var izraisīt biežas kontroles vizītes, nevajadzīgas iejaukšanās un pārmērīgu ārstēšanu. Seruma metabolisma klasifikatoru ar diagnostisku vērtību iekļaušana var uzlabot riska novērtējumu un sekojošu plaušu mezgliņu ārstēšanu. PET pozitronu emisijas tomogrāfija.
ASV NLST pētījuma un Eiropas NELSON pētījuma dati liecina, ka augsta riska grupu skrīnings ar zemas devas datortomogrāfiju (LDCT) var samazināt plaušu vēža mirstību1,3. Tomēr riska novērtēšana un sekojoša klīniskā ārstēšana, ja liels skaits nejauši plaušu mezgliņu tiek atklāti ar LDCT, joprojām ir visizaicinošākais. Galvenais mērķis ir optimizēt esošo uz LDCT balstīto protokolu pareizu klasifikāciju, iekļaujot uzticamus biomarķierus.
Salīdzinot plaušu vēža pacientus ar veseliem kontroles subjektiem, ir identificēti daži molekulāri biomarķieri, piemēram, asins metabolīti15,17. Šajā pētījumā mēs koncentrējāmies uz seruma metabolomikas analīzes pielietošanu, lai atšķirtu labdabīgus un ļaundabīgus plaušu mezgliņus, kas nejauši atklāti ar LDCT. Mēs salīdzinājām veselu kontroles subjektu (HC), labdabīgu plaušu mezgliņu (BN) un I stadijas plaušu adenokarcinomas (LA) paraugu globālo seruma metabolomu, izmantojot UPLC-HRMS analīzi. Mēs atklājām, ka HC un BN ir līdzīgi metabolisma profili, savukārt LA uzrādīja būtiskas izmaiņas salīdzinājumā ar HC un BN. Mēs identificējām divus seruma metabolītu kopumus, kas atšķir LA no HC un BN.
Pašreizējā uz LDCT balstītā labdabīgu un ļaundabīgu mezgliņu identifikācijas shēma galvenokārt balstās uz mezgliņu izmēru, blīvumu, morfoloģiju un augšanas ātrumu laika gaitā30. Iepriekšējie pētījumi liecina, ka mezgliņu izmērs ir cieši saistīts ar plaušu vēža iespējamību. Pat augsta riska pacientiem ļaundabīgo audzēju risks mezgliņos, kuru izmērs ir <6 mm, ir <1%. Ļaundabīgo audzēju risks mezgliņiem, kuru izmērs ir no 6 līdz 20 mm, svārstās no 8% līdz 64%30. Tāpēc Fleišnera biedrība iesaka ikdienas datortomogrāfijas novērošanai izmantot 6 mm robeždiametru.29 Tomēr nenoteiktu plaušu mezgliņu (IPN), kas lielāki par 6 mm, riska novērtēšana un ārstēšana nav pienācīgi veikta31. Pašreizējā iedzimtu sirds slimību ārstēšana parasti balstās uz modru gaidīšanu ar biežu datortomogrāfijas uzraudzību.
Pamatojoties uz validēto metabolomu, mēs pirmo reizi parādījām metabolomisko parakstu pārklāšanos starp veseliem indivīdiem un labdabīgiem mezgliņiem <6 mm. Bioloģiskā līdzība atbilst iepriekšējiem datortomogrāfijas atklājumiem, ka ļaundabīgo audzēju risks mezgliņiem <6 mm ir tikpat zems kā subjektiem bez limfmezgliem.30 Jāatzīmē, ka mūsu rezultāti arī parāda, ka labdabīgiem mezgliņiem <6 mm un ≥6 mm ir augsta līdzība metabolomiskajos profilos, kas liecina, ka labdabīgas etioloģijas funkcionālā definīcija ir konsekventa neatkarīgi no mezgliņa lieluma. Tādējādi mūsdienu diagnostikas seruma metabolītu paneļi var nodrošināt vienotu testu kā izslēgšanas testu, kad mezgliņi sākotnēji tiek atklāti datortomogrāfijā, un potenciāli samazināt sērijveida uzraudzību. Tajā pašā laikā tas pats metabolisko biomarķieru panelis atšķīra ļaundabīgus mezgliņus ≥6 mm lielumā no labdabīgiem mezgliņiem un sniedza precīzas prognozes par līdzīga izmēra IPN un neskaidrām morfoloģiskām iezīmēm datortomogrāfijas attēlos. Šis seruma metabolisma klasifikators labi darbojās, prognozējot mezgliņu ≥6 mm ļaundabīgo audzēju ar AUC 0,927. Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka unikāli seruma metabolomiskie paraksti var īpaši atspoguļot agrīnas audzēja izraisītas vielmaiņas izmaiņas un tiem var būt potenciāla vērtība kā riska prognozētājiem neatkarīgi no mezgliņu lieluma.
Jāatzīmē, ka plaušu adenokarcinoma (LUAD) un plakanšūnu karcinoma (LUSC) ir galvenie nesīkšūnu plaušu vēža (NSCLC) veidi. Ņemot vērā, ka LUSC ir cieši saistīta ar tabakas lietošanu47 un LUAD ir visbiežāk sastopamā nejaušo plaušu mezgliņu histoloģija, kas tiek atklāta DT skrīningā48, mūsu klasifikatora modelis tika īpaši izveidots I stadijas adenokarcinomas paraugiem. Vangs un viņa kolēģi arī koncentrējās uz LUAD un, izmantojot lipidomiku, identificēja deviņus lipīdu parakstus, lai atšķirtu agrīnas stadijas plaušu vēzi no veseliem indivīdiem17. Mēs pārbaudījām pašreizējo klasifikatora modeli 16 I stadijas LUSC un 74 labdabīgu mezgliņu gadījumos un novērojām zemu LUSC prognozēšanas precizitāti (AUC 0,776), kas liecina, ka LUAD un LUSC var būt savi metabolomiskie paraksti. Patiešām, ir pierādīts, ka LUAD un LUSC atšķiras pēc etioloģijas, bioloģiskās izcelsmes un ģenētiskām aberācijām49. Tāpēc skrīninga programmās plaušu vēža noteikšanai populācijā balstītos apmācības modeļos jāiekļauj citi histoloģijas veidi.
Šeit mēs identificējām sešus visbiežāk mainītos plaušu adenokarcinomas ceļus, salīdzinot ar veseliem kontroles pacientiem un labdabīgiem mezgliņiem. Ksantīns un hipoksantīns ir bieži sastopami purīnu metabolisma ceļa metabolīti. Saskaņā ar mūsu rezultātiem, ar purīnu metabolismu saistīto starpproduktu līmenis plaušu adenokarcinomas pacientu serumā vai audos bija ievērojami paaugstināts, salīdzinot ar veseliem kontroles pacientiem vai pacientiem pirms invazīvās stadijas15,50. Paaugstināts ksantīna un hipoksantīna līmenis serumā var atspoguļot anabolismu, kas nepieciešams strauji proliferējošām vēža šūnām. Glikozes metabolisma disregulācija ir labi zināma vēža metabolisma pazīme51. Šeit mēs novērojām ievērojamu piruvāta un laktāta līmeņa paaugstināšanos LA grupā, salīdzinot ar HC un BN grupu, kas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem par glikolītiskā ceļa anomālijām nesīkšūnu plaušu vēža (NSCLC) pacientu un veselu kontroles pacientu seruma metabolomu profilos. Rezultāti ir konsekventi52,53.
Svarīgi, ka plaušu adenokarcinomu serumā mēs novērojām apgrieztu korelāciju starp piruvāta un triptofāna metabolismu. LA grupā seruma triptofāna līmenis bija samazināts, salīdzinot ar HC vai BN grupu. Interesanti, ka iepriekšējā plaša mēroga pētījumā, izmantojot prospektīvu kohortu, tika atklāts, ka zems cirkulējošā triptofāna līmenis bija saistīts ar paaugstinātu plaušu vēža risku 54. Triptofāns ir neaizvietojama aminoskābe, ko mēs pilnībā uzņemam ar pārtiku. Mēs secinām, ka triptofāna līmeņa samazināšanās serumā plaušu adenokarcinomas gadījumā var atspoguļot šī metabolīta strauju samazināšanos. Ir labi zināms, ka triptofāna katabolisma gala produkts, izmantojot kinurenīna ceļu, ir de novo NAD+ sintēzes avots. Tā kā NAD+ tiek ražots galvenokārt caur glābšanas ceļu, NAD+ nozīme triptofāna metabolismā veselībā un slimībā vēl jānosaka 46. Mūsu TCGA datubāzes analīze parādīja, ka triptofāna transportētāja šķīdinātāja transportētāja 7A5 (SLC7A5) ekspresija plaušu adenokarcinomas gadījumā bija ievērojami palielināta, salīdzinot ar normālu kontroles grupu, un tā bija pozitīvi korelēta ar glikolītiskā enzīma GAPDH ekspresiju. Iepriekšējie pētījumi galvenokārt ir koncentrējušies uz triptofāna katabolisma lomu pretvēža imūnās atbildes nomākšanā40,41,42. Šeit mēs parādām, ka triptofāna uzņemšanas inhibīcija, nomācot SLC7A5 plaušu vēža šūnās, izraisa sekojošu šūnu NAD līmeņa samazināšanos un vienlaicīgu glikolītiskās aktivitātes vājināšanos. Rezumējot, mūsu pētījums sniedz bioloģisku pamatu izmaiņām seruma metabolismā, kas saistītas ar plaušu adenokarcinomas ļaundabīgu transformāciju.
EGFR mutācijas ir visbiežāk sastopamās virzītājspēka mutācijas pacientiem ar nesīkšūnu plaušu vēzi (NSCLC). Mūsu pētījumā mēs atklājām, ka pacientiem ar EGFR mutāciju (n = 41) bija kopējie metabolomiskie profili, kas bija līdzīgi pacientiem ar savvaļas tipa EGFR (n = 31), lai gan dažiem EGFR mutantu pacientiem acilkarnitīna pacientiem mēs konstatējām pazeminātu seruma līmeni. Pierādīta acilkarnitīnu funkcija ir transportēt acilgrupas no citoplazmas uz mitohondriju matricu, kas noved pie taukskābju oksidēšanās enerģijas ražošanai55. Saskaņā ar mūsu atklājumiem nesenā pētījumā, analizējot 102 plaušu adenokarcinomas audu paraugu globālo metabolomu50, tika identificēti līdzīgi metabolomu profili starp EGFR mutantu un EGFR savvaļas tipa audzējiem. Interesanti, ka acilkarnitīna saturs tika konstatēts arī EGFR mutantu grupā. Tādēļ, vai acilkarnitīna līmeņa izmaiņas atspoguļo EGFR izraisītas vielmaiņas izmaiņas un pamatā esošos molekulāros ceļus, varētu būt nepieciešama turpmāka izpēte.
Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pētījumā ir izveidots seruma metabolisma klasifikators plaušu mezgliņu diferenciāldiagnozei un ierosināta darbplūsma, kas var optimizēt riska novērtējumu un atvieglot klīnisko pārvaldību, pamatojoties uz datortomogrāfijas skrīningu.
Šo pētījumu apstiprināja Sun Yat-sen Universitātes Vēža slimnīcas ētikas komiteja, Sun Yat-sen Universitātes Pirmā saistītā slimnīca un Džendžou Universitātes Vēža slimnīcas ētikas komiteja. Atklāšanas un iekšējās validācijas grupās tika savākti 174 serumi no veseliem indivīdiem un 244 serumi no labdabīgiem mezgliņiem no indivīdiem, kuriem tika veiktas ikgadējās medicīniskās pārbaudes Sun Yat-sen Universitātes Vēža centra Vēža kontroles un profilakses nodaļā, un 166 labdabīgi mezgliņi. I stadijas plaušu adenokarcinomas tika savāktas no Sun Yat-sen Universitātes Vēža centra. Ārējās validācijas kohortā bija 48 labdabīgu mezgliņu gadījumi, 39 I stadijas plaušu adenokarcinomas gadījumi no Sun Yat-sen Universitātes Pirmā saistītā slimnīcas un 24 I stadijas plaušu adenokarcinomas gadījumi no Džendžou Vēža slimnīcas. Sun Yat-sen Universitātes Vēža centrs savāca arī 16 I stadijas plakanšūnu plaušu vēža gadījumus, lai pārbaudītu noteiktā metabolisma klasifikatora diagnostiskās spējas (pacientu raksturojums ir parādīts 5. papildtabulā). Atklāšanas kohortas un iekšējās validācijas kohortas paraugi tika savākti laikā no 2018. gada janvāra līdz 2020. gada maijam. Ārējās validācijas kohortas paraugi tika savākti laikā no 2021. gada augusta līdz 2022. gada oktobrim. Lai mazinātu dzimumu neobjektivitāti, katrā kohortā tika piešķirts aptuveni vienāds vīriešu un sieviešu skaits. Atklāšanas komanda un iekšējās pārskatīšanas komanda. Dalībnieku dzimums tika noteikts, pamatojoties uz pašziņojumu. No visiem dalībniekiem tika iegūta informēta piekrišana, un kompensācija netika sniegta. Subjekti ar labdabīgiem mezgliņiem bija tie, kuriem analīzes laikā bija stabils datortomogrāfijas skenēšanas rezultāts 2 līdz 5 gadus, izņemot 1 gadījumu no ārējās validācijas parauga, kas tika savākts pirms operācijas un diagnosticēts ar histopatoloģiju. Izņemot hronisku bronhītu. Plaušu adenokarcinomas gadījumi tika savākti pirms plaušu rezekcijas un apstiprināti ar patoloģisku diagnozi. Tukšā dūšā asins paraugi tika savākti seruma atdalīšanas mēģenēs bez antikoagulantiem. Asins paraugi tika recināti 1 stundu istabas temperatūrā un pēc tam centrifugēti ar 2851 × g 10 minūtes 4°C temperatūrā, lai savāktu seruma supernatantu. Seruma alikvotas tika sasaldētas -80°C temperatūrā līdz metabolītu ekstrakcijai. Sun Yat-sen Universitātes Vēža centra Vēža profilakses un medicīniskās izmeklēšanas nodaļa savāca seruma kopumu no 100 veseliem donoriem, tostarp vienāda skaita vīriešiem un sievietēm vecumā no 40 līdz 55 gadiem. Katra donora parauga vienādi tilpumi tika sajaukti, iegūtais kopums tika sadalīts alikvotās daļās un uzglabāts -80°C temperatūrā. Seruma maisījums tika izmantots kā references materiāls kvalitātes kontrolei un datu standartizācijai.
Atsauces seruma un testa paraugi tika atkausēti, un metabolīti tika ekstrahēti, izmantojot kombinēto ekstrakcijas metodi (MTBE/metanols/ūdens)56. Īsumā, 50 μl seruma tika sajaukti ar 225 μl ledusauksta metanola un 750 μl ledusauksta metil-terc-butilētera (MTBE). Maisījumu samaisa un inkubē uz ledus 1 stundu. Pēc tam paraugus sajauca un vorteksā sajauca ar 188 μl MS kvalitātes ūdens, kas saturēja iekšējos standartus (13C-laktātu, 13C3-piruvātu, 13C-metionīnu un 13C6-izoleicīnu, iegādātus no Cambridge Isotope Laboratories). Pēc tam maisījumu centrifugēja ar 15 000 × g 10 minūtes 4 °C temperatūrā, un apakšējā fāze tika pārvietota divās mēģenēs (katrā 125 μl) LC-MS analīzei pozitīvajā un negatīvajā režīmā. Visbeidzot, paraugs tika iztvaicēts līdz sausam masas daudzumam ātrgaitas vakuuma koncentratorā.
Žāvētos metabolītus atšķaidīja 120 μl 80% acetonitrila, 5 minūtes kratīja un 10 minūtes 4°C temperatūrā centrifugēja ar ātrumu 15 000 × g. Metabolomikas pētījumiem supernatanti tika pārvietoti dzintarkrāsas stikla flakonos ar mikroieliktņiem. Nemērķtiecīga metabolomikas analīze tika veikta, izmantojot īpaši efektīvas šķidruma hromatogrāfijas-augstas izšķirtspējas masas spektrometrijas (UPLC-HRMS) platformu. Metabolīti tika atdalīti, izmantojot Dionex Ultimate 3000 UPLC sistēmu un ACQUITY BEH amīda kolonnu (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Pozitīvo jonu režīmā kustīgās fāzes bija 95% (A) un 50% acetonitrila (B), katra saturot 10 mmol/L amonija acetāta un 0,1% skudrskābes. Negatīvajā režīmā mobilās fāzes A un B saturēja attiecīgi 95% un 50% acetonitrila, abas fāzes saturēja 10 mmol/l amonija acetāta, pH = 9. Gradienta programma bija šāda: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. Kolonna tika uzturēta 40°C temperatūrā, bet paraugs – 10°C temperatūrā automātiskajā paraugu ņemšanas ierīcē. Plūsmas ātrums bija 0,3 ml/min, injekcijas tilpums bija 3 μl. Q-Exactive Orbitrap masas spektrometrs (Thermo Fisher Scientific) ar elektroizsmidzināšanas jonizācijas (ESI) avotu tika darbināts pilnas skenēšanas režīmā un savienots ar ddMS2 uzraudzības režīmu, lai apkopotu lielu datu apjomu. MS parametri tika iestatīti šādi: izsmidzināšanas spriegums +3,8 kV/- 3,2 kV, kapilāra temperatūra 320 °C, aizsarggāze 40 arb, palīggāze 10 arb, zondes sildītāja temperatūra 350 °C, skenēšanas diapazons 70–1050 m/h, izšķirtspēja 70 000. Dati tika iegūti, izmantojot Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Lai novērtētu datu kvalitāti, tika ģenerēti apvienoti kvalitātes kontroles (KK) paraugi, no katra parauga noņemot 10 μL supernatāta alikvotas. Analītiskās secības sākumā tika analizētas sešas kvalitātes kontroles paraugu injekcijas, lai novērtētu UPLC-MS sistēmas stabilitāti. Pēc tam partijā periodiski tiek ievadīti kvalitātes kontroles paraugi. Visas 11 seruma paraugu partijas šajā pētījumā tika analizētas ar LC-MS. 100 veselu donoru seruma apvienotā maisījuma alikvotas tika izmantotas kā references materiāls attiecīgajās partijās, lai uzraudzītu ekstrakcijas procesu un pielāgotu partiju savstarpējo ietekmi. Sun Yat-sen universitātes Metabolomikas centrā tika veikta atklāšanas kohortas, iekšējās validācijas kohortas un ārējās validācijas kohortas nemērķēta metabolomikas analīze. Guangdong Tehnoloģiju universitātes Analīzes un testēšanas centra ārējā laboratorija arī analizēja 40 paraugus no ārējās kohortas, lai pārbaudītu klasifikatora modeļa veiktspēju.
Pēc ekstrakcijas un rekonstitūcijas seruma metabolītu absolūtā kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot īpaši augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas-tandēma masas spektrometriju (Agilent 6495 trīskāršais kvadrupols) ar elektroizsmidzināšanas jonizācijas (ESI) avotu vairāku reakciju uzraudzības (MRM) režīmā. Metabolītu atdalīšanai tika izmantota ACQUITY BEH amīda kolonna (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilā fāze sastāvēja no 90% (A) un 5% acetonitrila (B) ar 10 mmol/L amonija acetāta un 0,1% amonjaka šķīduma. Gradienta programma bija šāda: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0%B. Kolonna tika uzturēta 40 °C temperatūrā, bet paraugs automātiskajā paraugu ņemšanas ierīcē — 10 °C temperatūrā. Plūsmas ātrums bija 0,3 ml/min, un injekcijas tilpums bija 1 μL. MS parametri tika iestatīti šādi: kapilārā spriegums ±3,5 kV, smidzinātāja spiediens 35 psi, apvalka gāzes plūsma 12 l/min, apvalka gāzes temperatūra 350 °C, žāvēšanas gāzes temperatūra 250 °C un žāvēšanas gāzes plūsma 14 l/min. Triptofāna, piruvāta, laktāta, hipoksantīna un ksantīna MRM konversijas bija attiecīgi 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 un 151,0–107,9. Dati tika apkopoti, izmantojot Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Seruma paraugos triptofāna, piruvāta, laktāta, hipoksantīna un ksantīna daudzums tika noteikts kvantitatīvi, izmantojot standarta maisījumu šķīdumu kalibrēšanas līknes. Šūnu paraugos triptofāna saturs tika normalizēts attiecībā pret iekšējo standartu un šūnu olbaltumvielu masu.
Pīķa ekstrakcija (m/z un aiztures laiks (RT)) tika veikta, izmantojot Compound Discovery 3.1 un TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Lai novērstu iespējamās atšķirības starp partijām, katrs testa parauga raksturīgais pīķis tika dalīts ar atsauces materiāla raksturīgo pīķi no tās pašas partijas, lai iegūtu relatīvo daudzumu. Iekšējo standartu relatīvās standartnovirzes pirms un pēc standartizācijas ir parādītas 6. papildtabulā. Atšķirības starp abām grupām tika raksturotas ar kļūdainu atklāšanas līmeni (FDR < 0,05, Vilkoksona zīmju rangu tests) un reizes izmaiņām (> 1,2 vai < 0,83). Neapstrādāti ekstrahēto pazīmju MS dati un atsauces seruma koriģētie MS dati ir parādīti attiecīgi 1. un 2. papilddatos. Pīķa anotācija tika veikta, pamatojoties uz četriem definētiem identifikācijas līmeņiem, tostarp identificētiem metabolītiem, iespējami anotētiem savienojumiem, iespējami raksturotām savienojumu klasēm un nezināmiem savienojumiem 22. Pamatojoties uz datubāzes meklēšanu Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), bioloģiskie savienojumi ar MS/MS atbilstību validētiem standartiem vai precīzas atbilstības anotācijām mzCloud (rādītājs > 85) vai Chemspider beidzot tika atlasīti kā starpprodukti starp diferenciālo metabolomu. Katras pazīmes maksimālās anotācijas ir iekļautas 3. papilddatos. MetaboAnalyst 5.0 tika izmantota vienfaktora summāri normalizēta metabolītu daudzuma analīzei. MetaboAnalyst 5.0 novērtēja arī KEGG ceļa bagātināšanas analīzi, pamatojoties uz būtiski atšķirīgiem metabolītiem. Galveno komponentu analīze (PCA) un daļējo mazāko kvadrātu diskriminantu analīze (PLS-DA) tika analizētas, izmantojot ropls programmatūras pakotni (1.26.4. v.) ar steka normalizāciju un automātisko mērogošanu. Optimālais metabolītu biomarķiera modelis mezgliņu ļaundabīguma prognozēšanai tika ģenerēts, izmantojot bināro loģistisko regresiju ar mazāko absolūto sašaurināšanu un atlases operatoru (LASSO, R pakotne 4.1-3. v.). Diskriminējošā modeļa veiktspēja noteikšanas un validācijas kopās tika raksturota, novērtējot AUC, pamatojoties uz ROC analīzi saskaņā ar pROC pakotni (v.1.18.0.). Optimālā varbūtības robežvērtība tika iegūta, pamatojoties uz modeļa maksimālo Jūdena indeksu (jutīgums + specifiskums – 1). Paraugi ar vērtībām, kas ir mazākas vai lielākas par robežvērtību, tiks prognozēti attiecīgi kā labdabīgi mezgliņi un plaušu adenokarcinoma.
A549 šūnas (#CCL-185, American Type Culture Collection) tika audzētas F-12K vidē, kas satur 10% FBS. Īsas matadata RNS (shRNS) sekvences, kas mērķētas uz SLC7A5, un nemērķējoša kontrole (NC), tika ievietotas lentivīrusu vektorā pLKO.1-puro. shSLC7A5 antisensu sekvences ir šādas: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antivielas pret SLC7A5 (#5347) un tubulīnu (#2148) tika iegādātas no Cell Signaling Technology. Antivielas pret SLC7A5 un tubulīnu tika izmantotas atšķaidījumā 1:1000 Western blot analīzei.
Seahorse XF glikolītiskā stresa tests mēra ekstracelulārās paskābināšanās (ECAR) līmeni. Testā secīgi tika ievadīta glikoze, oligomicīns A un 2-DG, lai pārbaudītu šūnu glikolītisko kapacitāti, ko mēra ar ECAR.
A549 šūnas, kas transfektētas ar ne-mērķa kontroles (NC) un shSLC7A5 (Sh1, Sh2), tika uz nakti ievietotas 10 cm diametra trauciņos. Šūnu metabolīti tika ekstrahēti ar 1 ml ledusauksta 80% metanola ūdens šķīduma. Šūnas metanola šķīdumā tika nokasītas, savāktas jaunā mēģenē un centrifugētas ar 15 000 × g 15 minūtes 4°C temperatūrā. Savāc 800 µl supernatanta un žāvē, izmantojot ātrgaitas vakuuma koncentratoru. Žāvēto metabolītu granulas pēc tam analizēja triptofāna līmeni, izmantojot LC-MS/MS, kā aprakstīts iepriekš. Šūnu NAD(H) līmenis A549 šūnās (NC un shSLC7A5) tika mērīts, izmantojot kvantitatīvu NAD+/NADH kolorimetrisko komplektu (#K337, BioVision) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Katram paraugam tika mērīts olbaltumvielu līmenis, lai normalizētu metabolītu daudzumu.
Lai provizoriski noteiktu izlases lielumu, netika izmantotas statistiskās metodes. Iepriekšējie metabolomikas pētījumi, kuru mērķis bija biomarķieru atklāšana15,18, tika uzskatīti par lieluma noteikšanas kritērijiem, un, salīdzinot ar šiem ziņojumiem, mūsu izlase bija atbilstoša. No pētījuma kohortas netika izslēgts neviens paraugs. Seruma paraugi tika nejauši iedalīti atklāšanas grupā (306 gadījumi, 74,6%) un iekšējās validācijas grupā (104 gadījumi, 25,4%) nemērķtiecīgiem metabolomikas pētījumiem. Mēs arī nejauši izvēlējāmies 70 gadījumus no katras grupas no atklāšanas kopas mērķtiecīgiem metabolomikas pētījumiem. Pētnieki nezināja, kāda ir grupu sadale LC-MS datu vākšanas un analīzes laikā. Metabolomikas datu un šūnu eksperimentu statistiskā analīze ir aprakstīta attiecīgajās sadaļās “Rezultāti”, “Attēlu leģendas” un “Metodes”. Šūnu triptofāna, NADT un glikolītiskās aktivitātes kvantitatīvā noteikšana tika veikta trīs reizes neatkarīgi ar identiskiem rezultātiem.
Lai iegūtu plašāku informāciju par pētījuma dizainu, skatiet ar šo rakstu saistīto Dabas portfeļa ziņojuma kopsavilkumu.
Neapstrādātie ekstrahēto pazīmju MS dati un atsauces seruma normalizētie MS dati ir parādīti attiecīgi 1. papilddatos un 2. papilddatos. Diferenciālo pazīmju maksimālās anotācijas ir sniegtas 3. papilddatos. LUAD TCGA datu kopu var lejupielādēt no https://portal.gdc.cancer.gov/. Ievades dati grafika attēlošanai ir sniegti avota datos. Šim rakstam ir sniegti avota dati.
Nacionālā plaušu skrīninga pētījumu grupa u.c. Plaušu vēža mirstības samazināšana ar zemas devas datortomogrāfiju. Ziemeļanglija. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR un Prophet, PC. Plaušu vēža skrīnings, izmantojot zemas devas spirālveida datortomogrāfiju: Nacionālā plaušu skrīninga pētījuma (NLST) rezultāti. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ u.c. Plaušu vēža mirstības samazināšana ar apjomīgās datortomogrāfijas skrīningu randomizētā pētījumā. Ziemeļanglija. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Publicēšanas laiks: 2023. gada 18. septembris